Chimica Organica-DiSTABiF

La metabolomica è una disciplina che studia l’insieme completo dei metaboliti presenti in un sistema biologico, come cellule, tessuti o organismi. Questa scienza rappresenta un’evoluzione delle scienze “omiche”, quali genomica, trascrittomica e proteomica, ed è particolarmente rilevante nell’ambito della biologia dei sistemi. Grazie all’integrazione di tecniche analitiche avanzate, come la spettrometria di massa (MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR), la metabolomica offre una visione globale e dettagliata del metabolismo cellulare.

Biologia dei Sistemi e il Ruolo della Metabolomica
La biologia dei sistemi è un approccio olistico che cerca di comprendere le interazioni complesse tra i vari componenti di un sistema biologico, dai livelli molecolari fino all’intero organismo. Essa si basa sull’idea che “il tutto è maggiore della somma delle sue parti”, e si avvale di modelli computazionali e matematici per descrivere tali interazioni. In questo contesto, la metabolomica fornisce informazioni chiave sullo stato funzionale delle cellule, evidenziando le attività metaboliche attuali e i cambiamenti indotti da stimoli esterni.
I metaboliti offrono una visione immediata di ciò che sta accadendo in un dato momento, completando le informazioni derivanti da DNA (ciò che è possibile), RNA (ciò che sembra stia accadendo) e proteine (ciò che lo rende possibile).

Applicazioni della Metabolomica

L’immagine illustra le principali applicazioni della metabolomica in biologia (pur non essendo esaustiva), suddivise in diversi ambiti tematici.

1. Chimica dei prodotti naturali
   La metabolomica viene utilizzata per analizzare i prodotti naturali, come alcaloidi, flavonoidi o terpeni. Questi composti trovano applicazione in ambito farmaceutico, agricolo e in molte altre scienze.
2. Risposta agli stress
   Studia come gli organismi viventi (ad esempio piante o animali) rispondono agli stress biotici (virus, batteri, funghi) e abiotici (temperatura, salinità, metalli pesanti). Questo è cruciale, ad esempio, per sviluppare colture più resistenti o per comprendere i meccanismi di adattamento.
3. Fisiologia
   L’analisi metabolomica consente di esaminare i processi fisiologici, come la fotosintesi, la respirazione e la biosintesi di carboidrati o lipidi, migliorando la comprensione del metabolismo nelle piante e in altri organismi.
4. Interazioni tra organismi
   Analizza le interazioni tra organismi, come la simbiosi, il parassitismo o la competizione, studiando i metaboliti scambiati o prodotti durante questi processi.
5. Tassonomia
   Permette di classificare gli organismi in base ai loro profili metabolici unici, fornendo un approccio complementare alla genetica e alla morfologia per la classificazione tassonomica.
6. Scienza degli alimenti
   La metabolomica è impiegata per studiare la composizione nutrizionale degli alimenti, la loro qualità, la sicurezza e le trasformazioni chimiche che avvengono durante la lavorazione o la conservazione.
7. Ricerca farmaceutica
   Aiuta nello sviluppo di nuovi farmaci identificando metaboliti bioattivi e nel comprendere meglio i meccanismi d’azione di farmaci già esistenti.
8. Biologia e chimica microbica
   Studia il metabolismo dei microrganismi per applicazioni come la produzione di antibiotici, enzimi o composti bioattivi.
9. Metabolismo umano e biomarcatori
   Questa categoria comprende l’identificazione di biomarcatori utili per diagnosticare malattie, monitorare la salute e sviluppare terapie personalizzate in ambito medico.
10. Scienza ambientale
    Analizza l’impatto dell’ambiente sui metaboliti, ad esempio studiando il bioaccumulo di contaminanti o le interazioni chimiche tra organismi e fattori ambientali.

La metabolomica trova, dunque, applicazione in diversi ambiti della biologia e delle scienze applicate:
• Chimica delle sostanze naturali: identificazione di composti bioattivi da fonti naturali, utili per lo sviluppo di farmaci e non solo.
Il processo classico di identificazione dei prodotti naturali è stato storicamente lungo e dispendioso in termini di risorse. Un esempio pratico è lo studio condotto su Astragalus boeticus, in cui l’astragaloside è stato identificato come un candidato promettente per applicazioni farmacologiche. Questo composto ha mostrato una selettività specifica contro linee cellulari resistenti ai farmaci, rendendolo un punto di partenza per ulteriori studi preclinici. Grazie all’integrazione della metabolomica, il processo di screening è stato ottimizzato, riducendo significativamente il tempo necessario per identificare tali bioattivi. La metabolomica, combinando analisi qualitative e quantitative simultanee di un ampio numero di metaboliti, accelera significativamente questa ricerca, consentendo di individuare rapidamente candidati promettenti per applicazioni terapeutiche.
• Analisi Funzionale e Annotazione dei Metaboliti
Un’altra area di interesse è l’annotazione funzionale dei metaboliti, ossia l’assegnazione di funzioni biologiche specifiche ai composti chimici identificati. Questo approccio è cruciale per comprendere i ruoli fisiologici dei metaboliti e le loro interazioni nei sistemi biologici.
• Chemotassonomia: classificazione degli organismi basata sulle loro caratteristiche biochimiche. Questa metodologia è applicata per distinguere specie di piante attraverso l’analisi dei loro metaboliti specializzati.
• Scienze alimentari: analisi della composizione chimica degli alimenti per migliorarne qualità e sicurezza. La metabolomica consente, ad esempio, di monitorare cambiamenti nei metaboliti durante i processi di trasformazione alimentare.
• Ricerca farmacologica: scoperta di nuovi biomarcatori e terapie mirate per malattie umane. L’identificazione di composti bioattivi attraverso approcci metabolomici offre nuove opportunità per la terapia personalizzata.
• Medicina: applicazioni in questo ambito includono tutti gli aspetti che riguardano la diagnosi precoce di malattie (es. cancro), permettendo l’identificazione di specifici biomarcatori. I biomarcatori possono essere utili anche per differenziare sottotipi di malattie apparentemente simili, migliorando la precisione diagnostica. Inoltre, l’analisi dei profili metabolici può essere utilizzata per valutare l’efficacia di trattamenti medici e personalizzarli. Grazie alla metabolomica, è possibile anche adattare i trattamenti in base al profilo metabolico individuale del paziente (medicina personalizzata). È inoltre possibile, analizzando il metabolismo alterato in pazienti con specifiche patologie, comprendere i meccanismi alla base di malattie complesse.
• Risposta allo stress: studio dei meccanismi di adattamento delle piante a condizioni avverse.
• Ecologia e Studio delle Interazioni Biologiche: la metabolomica permette di approfondire lo studio delle interazioni tra organismi. In particolare:

• Interazioni pianta-pianta: Un esempio pratico è rappresentato dagli studi sull’allelopatia, in cui estratti di piante donatrici come Arbutus unedo e Myrtus communis sono stati testati per valutare i loro effetti sulla crescita e sul metabolismo di specie riceventi come Medicago minima. Questi esperimenti hanno evidenziato una riduzione significativa della crescita delle piante riceventi, indicando la presenza di composti allelopatici attivi.
• Interazioni pianta-microrganismi: La metabolomica permette, ad esempio, di rilevare metaboliti chiave coinvolti nella simbiosi tra piante e microbi benefici.
• Interazioni pianta-animale: La metabolomica può, ad esempio, essere usata per studiare composti volatili che le piante rilasciano in risposta all’attacco da parte di insetti erbivori, modulando il comportamento di predatori naturali degli insetti stessi e rafforzando le difese delle piante.
  

Limiti e Sfide della Metabolomica

Nonostante i progressi, la metabolomica presenta alcune limitazioni. Ad esempio, nella stima dei flussi metabolici (fluxomics), una sfida significativa è rappresentata dalla complessità delle reti metaboliche. L’uso di isotopi marcati consente di monitorare i flussi metabolici attraverso esperimenti di labelling, ma l’interpretazione dei dati è complicata da fenomeni come i cicli futili e l’alto grado di interconnessione tra i pathway metabolici. Un esempio pratico riguarda l’analisi dei flussi in percorsi biosintetici lineari, dove l’equilibrio tra gli input e gli output può essere calcolato solo in condizioni sperimentali rigorosamente controllate.

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La metabolomica è una disciplina cardine nella biologia moderna, con il potenziale di rivoluzionare la nostra comprensione dei sistemi biologici. Grazie alla sua capacità di fornire una visione globale e dettagliata del metabolismo, questa scienza continuerà a contribuire significativamente a molteplici settori della ricerca e delle applicazioni in diversi ambiti.

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Utilizzando il seguente link, è possibile scaricare le slide dell’ultima lezione: https://www.dropbox.com/scl/fi/xjkdhspx3qirtqb61ikmu/11.-Metabolomica-in-biologia.pdf?rlkey=w3p94cto02mxinwi9yhmi6zez&st=b8xoyyjn&dl=0

Nel contesto della metabolomica, gli approcci di analisi statistica più comuni si suddividono in metodi univariati e multivariati. Ogni metodo offre approfondimenti unici sulla struttura dei dati. L’analisi multivariata opera su una matrice di variabili e mette in evidenza le caratteristiche basandosi sulle relazioni tra tutte le variabili. L’analisi univariata considera invece una sola variabile alla volta, producendo risultati ponderati in modo diverso.

L’obiettivo dell’analisi statistica è la categorizzazione e la previsione delle proprietà dei campioni attraverso la generazione di modelli che catturano le informazioni contenute nelle matrici di dati. Nella spettrometria di massa, il rapporto m/z e l’intensità del segnale sono le due variabili più importanti. Nell’NMR selezioniamo i segnali integrati di interesse per l’analisi dei dati.

Nell’ambito dell’analisi multivariata, distinguiamo metodi supervised e unsupervised come i due principali approcci di analisi statistica e machine learning utilizzati per analizzare i dati.

Metodi Unsupervised

I metodi unsupervised non richiedono etichette o variabili di output predefinite. L’obiettivo è esplorare la struttura intrinseca dei dati, trovando pattern, gruppi o caratteristiche rilevanti.

Caratteristiche principali:

• No etichette: Non esistono etichette a priori; i metodi cercano di individuare somiglianze o differenze nei dati.
• Scoperta di pattern: Sono utilizzati per esplorare i dati e identificare raggruppamenti naturali o ridurre la dimensionalità.
• Esempi di metodi unsupervised:
  • Clustering: Algoritmi come Hierarchical Clustering dividono i dati in gruppi basati su similarità.
  • Riduzione della dimensionalità: Metodi come PCA (Principal Component Analysis) semplificano la rappresentazione dei dati preservandone le caratteristiche principali.

Metodi Supervised

I metodi supervised richiedono un set di dati etichettati, in cui ogni campione è associato a un’etichetta o a una variabile di output nota (ad esempio, classe, valore numerico, ecc.). L’obiettivo principale è costruire un modello che sia in grado di prevedere accuratamente l’etichetta per nuovi dati non etichettati.

Caratteristiche principali:

• Training su dati etichettati: Si utilizza un insieme di dati noti (training set) per apprendere la relazione tra le variabili indipendenti (input) e le etichette (output).
• Predizione: Una volta addestrato, il modello può essere utilizzato per prevedere le etichette di nuovi campioni.
• Esempi di metodi supervised in metabolomica: PLS-DA (Partial Least Square – DIscriminant Analysis)

Analisi delle Componenti Principali (PCA)

L’Analisi delle Componenti Principali (PCA, Principal Component Analysis) è una tecnica di riduzione della dimensionalità utilizzata per semplificare set di dati complessi preservandone le caratteristiche più rilevanti. È ampiamente impiegata in numerosi campi, come la metabolomica, la genetica, l’analisi di immagini, e altre discipline che gestiscono dati ad alta dimensionalità.

Obiettivo della PCA

La PCA mira a trasformare un set di dati originale (caratterizzato da molte variabili correlate) in un nuovo sistema di coordinate, chiamato componenti principali. Queste componenti:

1. Sono ortogonali (non correlate tra loro).
2. Catturano la varianza massima: la prima componente principale (PC1) cattura la maggior parte della varianza nei dati, seguita dalla seconda (PC2), e così via.

Questo processo consente di rappresentare i dati con un numero inferiore di variabili, riducendo la complessità ma mantenendo la maggior parte dell’informazione.
Come vengono calcolate le componenti principali? Vedi il materiale presente al link “DATA ANALYSIS” sotto per io dettagli. Fondamentalmente, si scelgono le componenti principali che spiegano una frazione significativa della varianza totale (ad esempio, il 95%) e i dati originali vengono trasformati nel nuovo sistema di coordinate formato dalle componenti principali.

Grafici principali nella PCA

1. Score Plot

Lo score plot mostra la proiezione dei campioni nello spazio delle componenti principali selezionate (ad esempio, PC1 e PC2).

• Cosa rappresenta:
  • Ogni punto nel grafico corrisponde a un campione nel dataset.
  • Le coordinate di un campione sul grafico rappresentano i suoi punteggi (scores), ovvero i valori proiettati sulle componenti principali.
• Utilità:
  • Identifica pattern nei dati: ad esempio, raggruppamenti naturali, tendenze, o separazioni tra gruppi (es. malati vs sani).
  • Aiuta a rilevare outlier o campioni anomali.
• Esempio:
  • Un gruppo di campioni che si aggregano in una regione dello score plot può indicare una similarità tra di essi (ad esempio, appartenenza a una stessa classe).

2. Loading Plot

Il loading plot rappresenta i carichi (loadings), ovvero i coefficienti che descrivono il contributo delle variabili originali (metaboliti, geni, ecc.) alle componenti principali.

In uno studio metabolomico, un loading plot potrebbe evidenziare quali metaboliti sono responsabili della separazione tra gruppi di campioni osservata nello score plot.

Cosa rappresenta:

Ogni punto nel grafico corrisponde a una variabile originale. La posizione di una variabile indica quanto questa contribuisce a ciascuna componente principale.

Un loading plot sotto forma di istogramma è una rappresentazione alternativa dei carichi (loadings) che descrivono il contributo delle variabili originali (ad esempio, metaboliti, geni, segnali) a una specifica componente principale (PC). Invece di visualizzare i carichi come punti o vettori su un piano cartesiano (come accade nel loading plot tradizionale), in un istogramma ogni barra rappresenta il peso di una variabile su una determinata componente principale.

Caratteristiche del Loading Plot a Istogramma

• Asse X:
  • Rappresenta le variabili originali (es. nomi o numeri che identificano i metaboliti, geni, o segnali di interesse).
  • Ogni barra corrisponde a una variabile.
• Asse Y:
  • Indica il valore del carico (loading), che può essere positivo o negativo.
  • I valori positivi mostrano una correlazione diretta con la componente principale, mentre i valori negativi indicano una correlazione inversa.
• Altezza delle barre:
  • La lunghezza di ciascuna barra rappresenta il contributo della variabile alla specifica componente principale.
  • Variabili con barre più alte (in valore assoluto) hanno un’influenza maggiore sulla componente.

Utilità:

Identifica le variabili che influenzano maggiormente le componenti principali. Aiuta a interpretare la biologia o il fenomeno dietro ai pattern osservati nello score plot. Rileva correlazioni tra variabili: variabili vicine o nella stessa direzione possono essere correlate, mentre quelle opposte possono essere anti-correlate.

Qui potete scaricare il materiale utile allo studio dell’analisi dei dati di metabolomica: DATA ANALYSIS

Una volta ottenute le variabili significative, dovremo capire quali metaboliti si “nascondono” dietro queste variabili, ad esempio, analizzando i dati NMR.

NB: L’analisi metabolomica prevede vari step e ognuno di questi porta con se una certa variabilità.
La standardizzazione delle procedure analitiche, di analisi e presentazione dei dati è di fondamentale importanza per poter “parlare” un linguaggio comune che permetta di confrontare i risultati di esperimenti diversi.

Sul sito della Metabolomics Society, alla pagina dedicata, è possibile leggere informazioni importanti su questo punto. La pagina riporta anche una serie di link a progetti e pubblicazioni.

Oltre a quelle riportate sul sito, vi consiglio anche i “Proposed minimum reporting standards for chemical analysis” e “for data analysis” e l’articolo “Metabolite identification: are you sure? And how do your peers gauge your confidence?”