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NMR-based metabolomics

Una delle tecniche utilizzate in metabolomica è la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR).

Questa tecnica, che si basa sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni isotopi, ha tantissime applicazioni ed è certamente insostituibile quando si parla di caratterizzazione di composti organici. In questo contesto, ricordiamo che tra i nuclei attivi all’NMR ci sono l’idrogeno (1H) e il carbonio 13 (13C). La scarsa abbondanza naturale del 13C, insieme ad altre caratteristiche di questo nucleo, fanno sì che nel caso della metabolomica sia molto più pratico lavorare con 1H-NMR.

Dall’analisi NMR di un campione si possono dedurre tante informazioni diverse. Ma come si effettua un’analisi metabolomica mediante NMR?

A partire dal materiale liofilizzato, si ottengono gli estratti con una procedura molto semplice che prevede l’estrazione diretta in solventi deuterati (necessari per l’analisi NMR). Questi estratti vengono analizzati, ottenendo gli spettri, che saranno poi processati: questo processing prevede l’apodizzazione, la fasatura, la calibrazione rispetto allo standard intetno e la correzione della linea di base

A questo punto si procede con l’integrazione. Questa è effettuata attraverso il processo di bucketing o binnig: lo spettro si divide in tanti segmenti di lunghezza definita (in genere 0.02 o 0.04 ppm) e si procede ad integrare l’area sotto la curva di ogni bucket. Si ottiene in questo modo una matrice di dati in cui le osservazioni sono i singoli campioni analizzati e le variabili sono i vari bucket, che assumeranno quindi il valore dell’area per quella parte dello spettro in ciascun campione (NB: le aree sono in genere normalizzate rispetto allo standard interno a alla total intensity).

La matrice di dati così ottenuta è sottoposta ad analisi statistica multivariata. Questa sarà utile ad estrarre le informazioni significative dal nostro set di dati.

Una volta identificati i seganli NMR significativi per la nostra analisi, è necessario “tradurre” questi segnali in metaboliti. Si opera a questo punto per step successivi.
Il primo passaggio è quello del confronto con la letteratura e con i database. A questo proposito, è necessario sottolineare come l’NMR sia una metodica altamente riproducibile. In ogni caso, se questa ricerca non ci dà la risposta sperata, si può optare per l’analisi NMR bidimensionale (2D NMR).I metodi 2D NMR più utilizzati in metabolomica sono brevemente descritti di seguito.

COSY (COrrelation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare correlazioni omonucleari 1H-1H tra protoni vicinali e geminali

TOCSY (TOtal Correlation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin (il trasferimento di magnetizzazione è interrotto da carboni quaternari).

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni dirette protone-carbonio. Permette quindi di attribuire il valore di chemical shift del carbonio per ciascun carbonio protonato presente nell’estratto (o nella molecola, quando lo spettro si riferisce ad un composto puro)

H2BC (Heteronuclear 2 bond correlation)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e il carboni vicinale, a patto che quest’ultimo sia protonato.

Correlazioni selezionate indicate sullo spettro e sulla struttura con lo stesso colore

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e carboni distanti due, tre o quattro legami. Un esperimento alternativo è noto come CIGAR-HMBC.

Sono evidenziate le correlazioni del composto mostrato in alto a sinistra. Le altre correlazioni appartengono ad altre componenti dell’estratto.

HSQC-TOCSY

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin, che in questo caso includono sia i protoni sia i carboni.

Grazie alla combinazione delle informazioni che si ottengono dai diversi spettri 2D NMR, è possibile identificare i costituenti dell’estratto anche in miscela. Per metaboliti già noti, a questo punto sarà possibile confrontare i dati NMR con quelli riportati in letteratura o con quelli degli standard (a patto che siano acquisiti nello stesso solvente). Per i composti identificati per la prima volta, al fine di confermare la struttura, saranno necessari l’isolamento (che a questo punto sarà facilitato dalle informazioni preliminari in nostro possesso circa la struttura del composto) e la completa caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche.
Va infine ricordato che oltre ad identificare i componenti dell’estratto, è anche possibile quantificarli dato che l’ 1H NMR è una tecnica quantitativa (se gli spettri sono acquisiti con determinati parametri) e che è sufficiente in questo caso utilizzare uno standard interno a concentrazione nota.

Tecniche Analitiche in Metabolomica: NMR

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che non ha rivali nell’ambito della caratterizzazione strutturale. Questa tecnica spettroscopica, che sfrutta le proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi, ci permette di avere informazioni fondamentali sui composti organici. Non tutti i nuclei sono attivi all’NMR, ma tra quelli attivi si annoverano il protone e l’isotopo 13C del carbonio ed è proprio grazie all’applicazione a questi nuclei che otteniamo informazioni strutturali fondamentali per poter identificare la struttura dei composti.

Da uno spettro protonico possiamo dedurre numerose informazioni: il chemical shift ci dà informazioni su quello che è l’intorno chimico, la molteplicità ci dà informazioni sul numero di protoni legati ai carboni vicini (con le costanti di accoppiamento che ci forniscono altre importanti informazioni strutturali), infine l’integrazione ci permette di avere informazioni di tipo quantitativo.
L’utilizzo di techinche 2D-NMR, inoltre, ci dà la possibilità di ricostruire l’intero scheletro delle molecole.
In che modo possiamo sfruttare tutte queste potenzialità in metabolomica? Lo vedremo nel corso delle prossime lezioni.

Intanto, cerchiamo di capire meglio il principio di base su cui poggia questa potentissima tecnicha.
Di seguito, due video che possono aiutarci. Il primo, prodotto dalla Bruker, il secondo da Sciencesketch.

Curiosi anche di sapere come è fatto lo strumento all’interno? Date un’occhiata qui!

Tecniche analitiche in Metabolomica: Spettrometria di Massa

Le due tecniche più utilizzate ad oggi per acquisire i dati in metabolomica sono senza dubbio la spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risononanza magnetica nucleare (NMR).
La prima sfrutta la possibilità di generare e separare ioni in base al loro rapporto massa/carica. A lezione abbiamo visto che in realtà esistono tantissime applicazioni (ed “evoluzioni”) diverse di questa tecnica che la rendono particolarmente utile nell’analisi metabolomica. Il video seguente illustra, invece, il principio di base.

In una serie di video proposti dalla Waters, è possibile capire più a fondo il principio di funzionamente dell’ESI (Elettrospray ionization), che abbiamo visto essere insieme all’APCI e al MALDI (con tutte le variazioni sul tema viste a lezione) una delle tecniche di ionizzazione più diffuse quando la MS è utilizzata in metabolomica. Per quanto riguarda gli analizzatori, è possibile vedere come è fatto un quadrupolo.
Inoltre, è possibile approfondire la problematica della formazione di addotti, della formazione di specie con carica multipla, nonchè la questione dei picchi isotopici. Infine, viene affrontata la questione importantissima della risoluzione.

L’alta risoluzione è, in effetti, fondamentale nell’analisi metabolomica e, come abbiamo visto, anche l’applicazione della MS/MS aggiunge notevoli vantaggi in termini di determinazione dell’identità delle molecole. Nel seguente video è possibile seguire gli ioni nel loro cammino nel caso di un esperimento LC-MS/MS

Dal sito Bruker è possibile vedere come funziona un MALDI-TOF-TOF e da quello dell’Agilent come funziona un triplo quadrupolo associato ad un gas cromatografo o ad un HPLC/UPLC.

Le tecniche di HR-MS e MS/MS (o tandem MS) hanno notevolmente contribuito all’applicazione odierna di questa tecnica in campo metabolomico.
Inoltre, non va dimenticata la possibilità offerta dalle tecniche di imaging da un lato e dall’applicazione di tecnologie ancora più avanzate dall’altro.
Come non menzionare, allora, l’utilizzo della ion mobility mass spectrometry, che separa gli ioni non solo in base al rapporto massa/carica ma anche in funzione della loro grandezza e forma.

Le più recenti applicazioni della spettrometria di massa in metabolomica sono state trattate in una review recente “Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites” (Ren at al., RSC Advances, 2018).

Esercizi per i più coraggiosi

1. Scrivere il prodotto della seguente reazione

2. Proporre le condizioni di reazione e un meccanismo plausibile per le seguenti trasformazioni 

3) Un composto aciclico di formula C10H16 viene sottoposto ad ozonolisi. I prodotti ottenuti avranno le seguenti formule: CH2O, C3H6O, C3H4O2 e saranno in un rapporto di 1:1:2. Qual è il nome IUPAC (a meno della stereochimica) del composto iniziale?

Ancora qualche esercizio verso la III prova

1. Disegnare il diagramma energetico della reazione del 2-metil-2-butene con Br2 in H2O. Riportare sul grafico tutti gli intermedi di reazione e gli stadi di transizione per ciascuno stadio.

2. Partendo dall’opportuno alchene, illustrare il meccanismo di reazione che porterà alla sintesi del seguente composto. Indicare eventuali altri prodotti fornendo per tutti il nome IUPAC completo di stereochimica. 

3. Scrivere i prodotti principali delle seguenti reazioni, indicando la stereochimica quando opportuno

4. Mostrare il meccanismo della reazione del seguente composto con HBr. Mostrare la formazione di tutti i prodotti, mettendo in evidenza quale/i sarà/saranno i prodotti principali:

5. Disponi i seguenti composti in ordine di basicità crescente. Giustificare la risposta

6) Disponi i seguenti composti in ordine di reattività crescente in una reazione di addizione di acido alogenidrico. Giustificare la risposta

7.Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazioni o i prodotti mancanti. Evidenziare la stereochimica.    

8. Quali tra i seguenti carbocationi possono andare incontro a trasposizione?

CdL Scienze Biologiche- Avviso aule ricevimento, esercitazioni, prova intercorso

Ricevimenti prenotati per la mattinata del 23/11: Aula Gaia (I piano corpo A)
Ricevimenti prenotati per il pomeriggio del 23/11: Aula Biologia (ex SB) (piano terra corpo A)
Esercitazione del 23/11 (ore 16): aula D1. I ricevimenti post esercitazione si terrano in aula D1
Ricevimenti prenotati per la mattinata del 24/11: Aula Gaia (I piano corpo A)
Ricevimenti prenotati per il pomeriggio del 24/11: Aula B1

L’esercitazione+la lezione di venerdì si terranno regolarmente in Aula A1 (9-13)

La prova intercorso si terrà venerdì alle 16 in Aula A1 e A2 (gli elenchi saranno pubblicati venerdì). Gli studenti che hanno accumulato più di due assenze nel periodo intercorso tra la II e la III prova intercorso dovranno contattare la docente al più presto.

CdL Scienze Biologiche- Questionario in preparazione alle prossime esercitazioni

Seguendo il seguente link sarà possibile rispondere ad un questionario che sarà utile per la preparazione delle esercitazioni in vista della II prova intercorso.

Questo questionario di chiuderà questa sera alle 20:00

Raccomando a tutti la compilazione del questionario, in modo da mettere in evidenza problemi e lacune da colmare

Esercitazione…verso la III prova

1.A) Di seguito è mostrato il diagramma energetico della reazione di idratazione acido-catalizzata del 2-butene:

a) Cosa possiamo dire circa il ΔG° della reazione?
b) Cosa possiamo dire circa la Keq della reazione?
c) Di quanti stadi si compone la reazione?
d) Qual è lo stadio cineticamente determinante?
e) Indicare sul grafico l’energia di attivazione relativa a ciascuno stadio
f) Disegnare lo stato di transizione dello stadio cineticamente determinante.
g) Quanti intermedi si formano nel corso della reazione? Disegnarne la/le struttura/e.

1.B) Disegnare il diagramma energetico della reazione del 2-metil-2-butene con HCl e giustificare la regioselettività della reazione.

2. Scrivere i prodotti principali delle seguenti reazioni. Indicare la stereochimica, quando opportuno                                                   

Errata corrige. lettera A, terza freccia: il reagente è RCOOOH

3. Per ciascuno dei composti mostrati di seguito, partendo dall’opportuno alchene, illustrare il meccanismo di reazione. Indicare eventuali altri prodotti fornendo per tutti il nome IUPAC completo di stereochimica. 

4. Per ciascuna delle seguenti reazioni, mostrare il meccanismo che porta alla formazione del prodotto principale. Nel caso in cui sia possibile delocalizzazione elettronica per l’intermedio di reazione, mostrare tutte le strutture limite di risonanza che è possibile scrivere.

5.A) Disponi i seguenti composti in ordine di acidità crescente. Giustificare la risposta

5.B) Disponi i seguenti composti in ordine di basicità crescente. Giustificare la risposta

6) Disponi i seguenti composti in ordine di calore di idrogenazione decrescente. Giustificare la risposta

A) (E)-2-butene; (Z)-2-butene; 2-metil-2-butene

7.A) A partire dal 2-metil-2-butene, indicare le condizioni ottimali per ottenere ciascuno dei seguenti composti. Per ciascun prodotto, dire, inoltre, se quello formato è o meno l’unico prodotto di reazione. Se non lo è, indicare gli ulteriori altri prodotti formati, dire in che relazione sono col prodotto riportato e indicare se si formano o meno in quantità equimolari rispetto a quest’ultimo.

7.B) A partire dal (R)-1,5-dimetilcicloesene, indicare le condizioni ottimali per ottenere ciascuno dei seguenti composti. Per ciascun prodotto, dire, inoltre, se quello formato è o meno l’unico prodotto di reazione. Se non lo è, indicare gli ulteriori altri prodotti formati, dire in che relazione sono col prodotto riportato e indicare se si formano o meno in quantità equimolari rispetto a quest’ultimo.

Delocalizzazione elettronica

1) Quali delle seguenti specie hanno elettroni delocalizzati?

2) Scrivere le strutture limite di risonanza per le seguenti specie chimiche:

NB: per ora, tralasciare la lettera e

3) Disporre i seguenti carbocationi in ordine di stabilità crescente

4) Per ciascuna coppia, dire quale delle seguenti strutture limite di risonanza contribuisce in misura maggiore all’ibrido di risonanza:

5) Disporre i seguenti composti in ordine di acidità crescente e spiegare sinteticamente il perché:                           

6) Disporre i seguenti composti in ordine di acidità decrescente e spiegare sinteticamente il perché:                           

   

7) Quale dei seguenti composti è il più basico?

8) Quale delle seguenti aniline sostituite è la più basica?

9) Disporre i seguenti composti in ordine di basicità crescente e spiegare sinteticamente il perché: 

10) Propoporre i prodotti principali della reazione dei seguenti composti con acido bromidrico. Mostrare tutte le strutture di risonanza dell’intermedio carbocationico

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