Chimica Organica-DiSTABiF

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che non ha rivali nell’ambito della caratterizzazione strutturale. Questa tecnica spettroscopica, che sfrutta le proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi, ci permette di avere informazioni fondamentali sui composti organici. Non tutti i nuclei sono attivi all’NMR, ma tra quelli attivi si annoverano il protone e l’isotopo ¹³C del carbonio ed è proprio grazie all’applicazione a questi nuclei che otteniamo informazioni strutturali fondamentali per poter identificare la struttura dei composti.

Da uno spettro protonico possiamo dedurre numerose informazioni: il chemical shift ci dà informazioni su quello che è l’intorno chimico, la molteplicità ci dà informazioni sul numero di protoni legati ai carboni vicini (con le costanti di accoppiamento che ci forniscono altre importanti informazioni strutturali), infine l’integrazione ci permette di avere informazioni di tipo quantitativo.
L’utilizzo di techinche 2D-NMR, inoltre, ci dà la possibilità di ricostruire l’intero scheletro delle molecole.
In che modo possiamo sfruttare tutte queste potenzialità in metabolomica? Lo vedremo nel corso delle prossime lezioni.

Intanto, cerchiamo di capire meglio il principio di base su cui poggia questa potentissima tecnicha.
Di seguito, due video che possono aiutarci. Il primo, prodotto dalla Bruker, il secondo da Sciencesketch.

Curiosi anche di sapere come è fatto lo strumento all’interno? Date un’occhiata qui!

Le due tecniche più utilizzate ad oggi per acquisire i dati in metabolomica sono senza dubbio la spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risononanza magnetica nucleare (NMR).
La prima sfrutta la possibilità di generare e separare ioni in base al loro rapporto massa/carica. A lezione abbiamo visto che in realtà esistono tantissime applicazioni (ed “evoluzioni”) diverse di questa tecnica che la rendono particolarmente utile nell’analisi metabolomica. Il video seguente illustra, invece, il principio di base.

In una serie di video proposti dalla Waters, è possibile capire più a fondo il principio di funzionamente dell’ESI (Elettrospray ionization), che abbiamo visto essere insieme all’APCI e al MALDI (con tutte le variazioni sul tema viste a lezione) una delle tecniche di ionizzazione più diffuse quando la MS è utilizzata in metabolomica. Per quanto riguarda gli analizzatori, è possibile vedere come è fatto un quadrupolo.
Inoltre, è possibile approfondire la problematica della formazione di addotti, della formazione di specie con carica multipla, nonchè la questione dei picchi isotopici. Infine, viene affrontata la questione importantissima della risoluzione.

L’alta risoluzione è, in effetti, fondamentale nell’analisi metabolomica e, come abbiamo visto, anche l’applicazione della MS/MS aggiunge notevoli vantaggi in termini di determinazione dell’identità delle molecole. Nel seguente video è possibile seguire gli ioni nel loro cammino nel caso di un esperimento LC-MS/MS

Dal sito Bruker è possibile vedere come funziona un MALDI-TOF-TOF e da quello dell’Agilent come funziona un triplo quadrupolo associato ad un gas cromatografo o ad un HPLC/UPLC.

Le tecniche di HR-MS e MS/MS (o tandem MS) hanno notevolmente contribuito all’applicazione odierna di questa tecnica in campo metabolomico.
Inoltre, non va dimenticata la possibilità offerta dalle tecniche di imaging da un lato e dall’applicazione di tecnologie ancora più avanzate dall’altro.
Come non menzionare, allora, l’utilizzo della ion mobility mass spectrometry, che separa gli ioni non solo in base al rapporto massa/carica ma anche in funzione della loro grandezza e forma.

Le più recenti applicazioni della spettrometria di massa in metabolomica sono state trattate in una review recente “Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites” (Ren at al., RSC Advances, 2018).

Le tecniche cromatografiche rivestono un ruolo cruciale nell’analisi metabolomica.
Qui troverete alcuni video e animazioni che possono aiutarvi a visualizzare meglio alcune delle tecniche introdotte al corso.

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

HPLC

GC

La METABOLOMICA è un approccio innovativo allo studio dei fenomeni e dei sistemi biologici.

Innanzitutto, dobbiamo considerare l’ampio range di applicazioni di questo approccio allo studio dei sistemi biologici. Applicazioni che riguardano la chimica delle sostanze naturali, la chimica degli alimenti, la chimica farmaceutica, il metabolismo, la fisiologia e lo studio della risposta a stress da parte degli organismi e delle interazioni che tra essi intercorrono, la chimica ambientale, la ricerca biomedica e tantissimi altri campi.

Del resto, la metabolomica si colloca all’interfaccia tra la chimica e la biologia, in quanto ciascun fenomeno biologico produrrà una risposta chimica misurabile e la determinazione delle variazioni osservate fornirà informazioni sullo stato del sistema biologico in analisi. Inoltre, andando a misurare quelli che sono i prodotti finali dell’espressione genica, ossia i metaboliti, fornisce informazioni essenziali su quello che è il fenotipo e la relazione di quest’ultimo col genotipo.

Uno step fondamentale nell’approccio metabolomico è la fase di disegno sperimentale. Al fine di ottenere dati che siano statisticamente e biologicamente significativi e che diano risposta alla nostra research question, è necessario definire a priori tutti i parametri sperimentali da considerare, le variabili da valutare e quelle da controllare. Sarà necessario inoltre prendere in considerazione l’utilizzo di un numero opportuno di replicati tecnici e biologici (tale numero varia sia in base al sistema biologico in analisi, sia in base alle tecniche analitiche utilizzate).

A questo punto, sarà necessario procedere all’esecuzione dell’esperimento e/o al campionamento. Le metodiche utilizzate variano a seconda del tipo di campione, ma un punto fondamentale e ineludibile, al fine di ottenere risultati che rispecchino il reale stato del sistema, è il quenching del metabolismo: sarà necessario bloccare tutte le reazioni, siano esse catalizzate da enzimi o meno. In genere, questo si ottiene con il metodo del deep freezing, congelando il campione immediatamente in azoto liquido (-196°C). I campioni sono poi conservati a -80°C fino al momento della liofilizzazione. Quest’ultimo processo, che allontana l’acqua dal campione, è necessario sia per una migliore conservazione (l’acqua è il mezzo per la maggior parte delle reazioni che avvengono nei campioni biologici) sia (in alcuni casi) per rendere compatibile il campione con le successive analisi.

La maggior parte delle tecniche analitiche usate in metabolomica richiede che il campione sia in soluzione, di conseguenza il passaggio successivo consisterà in una procedura di estrazione dei metaboliti. In questo caso le metodiche variano sia in base alla natura del campione, sia in base alla piattaforma analitica che si utilizzerà nella fase successiva. Fase successiva che consiste nell’analisi della composizione chimica degli estratti. Diverse tecniche sono disponibili, ma quelle più comunemente utilizzate in metabolomica sono la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e la Spettrometria di Massa (MS). Quest’ultima richiede solitamente una separazione a monte dei metaboliti che compongono l’estratto ed è quindi in genere interfacciata con un sistema cromatografico (GC o HPLC/UPLC).

Una volta acquisiti i dati, il complesso dataset ottenuto è analizzato attraverso metodiche di analisi statistica multivariata (MVDA) al fine di estrarre le informazioni circa la classificazione dei campioni e circa i segnali e, in ultima analisi, i composti responsabili della classificazione osservata. A questo punto, si procede con la caratterizzazione strutturale dei composti che risultano essere significativi nell’analisi. Questa caratterizzazione si avvale, tra l’altro, di tecniche ad alta risoluzione e di spettrometria tandem, nel caso della MS. Nel caso dell’NMR una caratterizzazione dei metaboliti nell’estratto è possibile mediante l’utilizzo di tecniche NMR bidimensionali. Per entrambe le tecniche, un supporto notevole è fornito dai database.

Le informazioni estrapolate mediante MVDA vanno poi integrate con le conoscenze sul sistema biologico in analisi e forniranno la risposta alla domanda che sottende lo studio o forniranno nuove ipotesi da testare.

Per approfondimenti: Corso di Metabolomica

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