Chimica Organica-DiSTABiF

Tutti coloro che intendono seguire le lezioni di Metabolomica online potranno aggiungersi all’aula virtuale Teams utilizzando il seguente codice: g6m84dl

Una delle tecniche utilizzate in metabolomica è la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR).

Questa tecnica, che si basa sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni isotopi, ha tantissime applicazioni ed è certamente insostituibile quando si parla di caratterizzazione di composti organici. In questo contesto, ricordiamo che tra i nuclei attivi all’NMR ci sono l’idrogeno (¹H) e il carbonio 13 (¹³C). La scarsa abbondanza naturale del ¹³C, insieme ad altre caratteristiche di questo nucleo, fanno sì che nel caso della metabolomica sia molto più pratico lavorare con ¹H-NMR.

Dall’analisi NMR di un campione si possono dedurre tante informazioni diverse. Ma come si effettua un’analisi metabolomica mediante NMR?

A partire dal materiale liofilizzato, si ottengono gli estratti con una procedura molto semplice che prevede l’estrazione diretta in solventi deuterati (necessari per l’analisi NMR). Questi estratti vengono analizzati, ottenendo gli spettri, che saranno poi processati: questo processing prevede l’apodizzazione, la fasatura, la calibrazione rispetto allo standard intetno e la correzione della linea di base

A questo punto si procede con l’integrazione. Questa è effettuata attraverso il processo di bucketing o binnig: lo spettro si divide in tanti segmenti di lunghezza definita (in genere 0.02 o 0.04 ppm) e si procede ad integrare l’area sotto la curva di ogni bucket. Si ottiene in questo modo una matrice di dati in cui le osservazioni sono i singoli campioni analizzati e le variabili sono i vari bucket, che assumeranno quindi il valore dell’area per quella parte dello spettro in ciascun campione (NB: le aree sono in genere normalizzate rispetto allo standard interno a alla total intensity).

La matrice di dati così ottenuta è sottoposta ad analisi statistica multivariata. Questa sarà utile ad estrarre le informazioni significative dal nostro set di dati.

Una volta identificati i seganli NMR significativi per la nostra analisi, è necessario “tradurre” questi segnali in metaboliti. Si opera a questo punto per step successivi.
Il primo passaggio è quello del confronto con la letteratura e con i database. A questo proposito, è necessario sottolineare come l’NMR sia una metodica altamente riproducibile. In ogni caso, se questa ricerca non ci dà la risposta sperata, si può optare per l’analisi NMR bidimensionale (2D NMR).I metodi 2D NMR più utilizzati in metabolomica sono brevemente descritti di seguito.

COSY (COrrelation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare correlazioni omonucleari ¹H-¹H tra protoni vicinali e geminali

TOCSY (TOtal Correlation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin (il trasferimento di magnetizzazione è interrotto da carboni quaternari).

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni dirette protone-carbonio. Permette quindi di attribuire il valore di chemical shift del carbonio per ciascun carbonio protonato presente nell’estratto (o nella molecola, quando lo spettro si riferisce ad un composto puro)

H2BC (Heteronuclear 2 bond correlation)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e il carboni vicinale, a patto che quest’ultimo sia protonato.

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e carboni distanti due, tre o quattro legami. Un esperimento alternativo è noto come CIGAR-HMBC.

HSQC-TOCSY

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin, che in questo caso includono sia i protoni sia i carboni.

Grazie alla combinazione delle informazioni che si ottengono dai diversi spettri 2D NMR, è possibile identificare i costituenti dell’estratto anche in miscela. Per metaboliti già noti, a questo punto sarà possibile confrontare i dati NMR con quelli riportati in letteratura o con quelli degli standard (a patto che siano acquisiti nello stesso solvente). Per i composti identificati per la prima volta, al fine di confermare la struttura, saranno necessari l’isolamento (che a questo punto sarà facilitato dalle informazioni preliminari in nostro possesso circa la struttura del composto) e la completa caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche.
Va infine ricordato che oltre ad identificare i componenti dell’estratto, è anche possibile quantificarli dato che l’ ¹H NMR è una tecnica quantitativa (se gli spettri sono acquisiti con determinati parametri) e che è sufficiente in questo caso utilizzare uno standard interno a concentrazione nota.

A conclusione del corso di metabolomica, è qui presentata una panoramica di questo approccio analitico, che prevede l’analisi qualitativa e quantitativa di tutti i metaboliti presenti in un sistema biologico in determinate condizioni.

Innanzitutto, dobbiamo considerare l’ampio range di applicazioni di questo approccio allo studio dei sistemi biologici. Applicazioni che riguardano la chimica delle sostanze naturali, la chimica degli alimenti, la chimica farmaceutica, il metabolismo, la fisiologia e lo studio della risposta a stress da parte degli organismi e delle interazioni che tra essi intercorrono, la chimica ambientale, la ricerca biomedica e tantissimi altri campi.

Del resto, la metabolomica si colloca all’interfaccia tra la chimica e la biologia, in quanto ciascun fenomeno biologico produrrà una risposta chimica misurabile e la determinazione delle variazioni osservate fornirà informazioni sullo stato del sistema biologico in analisi. Inoltre, andando a misurare quelli che sono i prodotti finali dell’espressione genica, ossia i metaboliti, fornisce informazioni essenziali su quello che è il fenotipo e la relazione di quest’ultimo col genotipo.

Uno step fondamentale nell’approccio metabolomico è la fase di disegno sperimentale. Al fine di ottenere dati che siano statisticamente e biologicamente significativi e che diano risposta alla nostra research question, è necessario definire a priori tutti i parametri sperimentali da considerare, le variabili da valutare e quelle da controllare. Sarà necessario inoltre prendere in considerazione l’utilizzo di un numero opportuno di replicati tecnici e biologici (tale numero varia sia in base al sistema biologico in analisi, sia in base alle tecniche analitiche utilizzate).

A questo punto, sarà necessario procedere all’esecuzione dell’esperimento e/o al campionamento. Le metodiche utilizzate variano a seconda del tipo di campione, ma un punto fondamentale e ineludibile, al fine di ottenere risultati che rispecchino il reale stato del sistema, è il quenching del metabolismo: sarà necessario bloccare tutte le reazioni, siano esse catalizzate da enzimi o meno. In genere, questo si ottiene con il metodo del deep freezing, congelando il campione immediatamente in azoto liquido (-196°C). I campioni sono poi conservati a -80°C fino al momento della liofilizzazione. Quest’ultimo processo, che allontana l’acqua dal campione, è necessario sia per una migliore conservazione (l’acqua è il mezzo per la maggior parte delle reazioni che avvengono nei campioni biologici) sia (in alcuni casi) per rendere compatibile il campione con le successive analisi.

La maggior parte delle tecniche analitiche usate in metabolomica richiede che il campione sia in soluzione, di conseguenza il passaggio successivo consisterà in una procedura di estrazione dei metaboliti. In questo caso le metodiche variano sia in base alla natura del campione, sia in base alla piattaforma analitica che si utilizzerà nella fase successiva. Fase successiva che consiste nell’analisi della composizione chimica degli estratti. Diverse tecniche sono disponibili, ma quelle più comunemente utilizzate in metabolomica sono la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e la Spettrometria di Massa (MS). Quest’ultima richiede solitamente una separazione a monte dei metaboliti che compongono l’estratto ed è quindi in genere interfacciata con un sistema cromatografico (GC o HPLC/UPLC).

Una volta acquisiti i dati, il complesso dataset ottenuto è analizzato attraverso metodiche di analisi statistica multivariata (MVDA) al fine di estrarre le informazioni circa la classificazione dei campioni e circa i segnali e, in ultima analisi, i composti responsabili della classificazione osservata. A questo punto, si procede con la caratterizzazione strutturale dei composti che risultano essere significativi nell’analisi. Questa caratterizzazione si avvale, tra l’altro, di tecniche ad alta risoluzione e di spettrometria tandem, nel caso della MS. Nel caso dell’NMR una caratterizzazione dei metaboliti nell’estratto è possibile mediante l’utilizzo di tecniche NMR bidimensionali. Per entrambe le tecniche, un supporto notevole è fornito dai database.

Le informazioni estrapolate mediante MVDA vanno poi integrate con le conoscenze sul sistema biologico in analisi e forniranno la risposta alla domanda che sottende lo studio o forniranno nuove ipotesi da testare.

---

Sarà ormai chiaro quanto è complicato studiare un insieme così complesso di processi dinamici quali i network metabolici. Fondamentali sono le risorse bioinformatiche, ivi inclusi i database per l’analisi e la visualizzazione di pathway e network metabolici.
Qui troverete un elenco di alcune di queste risorse.

---

KEGG Pathway Database

MetaCyc è un altro database che riporta vie metaboliche determinate sperimentalmente da un vasto numero di organismi. Attualmente contiene 2847 pathway da 3161 organismi diversi. Le vie metaboliche sono sia del metabolismo primario che del metabolismo specializzato. Include inoltre informazioni su metaboliti, reazioni, enzimi e geni associati.

MetaCyc include le seguenti funzioni:
– Online encyclopedia of metabolism
– Predict metabolic pathways in sequenced genomes
– Support metabolic engineering via enzyme database
– Metabolite database aids metabolomics research.
Anche questo database è interattivo e ci sarà molto utile nell’analisi dei dati di metabolomica! Inoltre è collegato oad altri database di indubbia utilità per l’analisi metabolomica (BioCyc e simili).

---

Altri link utili:

• Metabomaps (è possibile fare una ricerca sia per via metabolica sia per organismo)
• Metabolic Pathways Roche
• Metabolic Pathways Merck
• Metabolic Pathways (central metabolism)

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che non ha rivali nell’ambito della caratterizzazione strutturale. Questa tecnica spettroscopica, che sfrutta le proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi, ci permette di avere informazioni fondamentali sui composti organici. Non tutti i nuclei sono attivi all’NMR, ma tra quelli attivi si annoverano il protone e l’isotopo ¹³C del carbonio ed è proprio grazie all’applicazione a questi nuclei che otteniamo informazioni strutturali fondamentali per poter identificare la struttura dei composti.

Da uno spettro protonico possiamo dedurre numerose informazioni: il chemical shift ci dà informazioni su quello che è l’intorno chimico, la molteplicità ci dà informazioni sul numero di protoni legati ai carboni vicini (con le costanti di accoppiamento che ci forniscono altre importanti informazioni strutturali), infine l’integrazione ci permette di avere informazioni di tipo quantitativo.
L’utilizzo di techinche 2D-NMR, inoltre, ci dà la possibilità di ricostruire l’intero scheletro delle molecole.
In che modo possiamo sfruttare tutte queste potenzialità in metabolomica? Lo vedremo nel corso delle prossime lezioni.

Intanto, cerchiamo di capire meglio il principio di base su cui poggia questa potentissima tecnicha.
Di seguito, due video che possono aiutarci. Il primo, prodotto dalla Bruker, il secondo da Sciencesketch.

Curiosi anche di sapere come è fatto lo strumento all’interno? Date un’occhiata qui!

Le due tecniche più utilizzate ad oggi per acquisire i dati in metabolomica sono senza dubbio la spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risononanza magnetica nucleare (NMR).
La prima sfrutta la possibilità di generare e separare ioni in base al loro rapporto massa/carica. A lezione abbiamo visto che in realtà esistono tantissime applicazioni (ed “evoluzioni”) diverse di questa tecnica che la rendono particolarmente utile nell’analisi metabolomica. Il video seguente illustra, invece, il principio di base.

In una serie di video proposti dalla Waters, è possibile capire più a fondo il principio di funzionamente dell’ESI (Elettrospray ionization), che abbiamo visto essere insieme all’APCI e al MALDI (con tutte le variazioni sul tema viste a lezione) una delle tecniche di ionizzazione più diffuse quando la MS è utilizzata in metabolomica. Per quanto riguarda gli analizzatori, è possibile vedere come è fatto un quadrupolo.
Inoltre, è possibile approfondire la problematica della formazione di addotti, della formazione di specie con carica multipla, nonchè la questione dei picchi isotopici. Infine, viene affrontata la questione importantissima della risoluzione.

L’alta risoluzione è, in effetti, fondamentale nell’analisi metabolomica e, come abbiamo visto, anche l’applicazione della MS/MS aggiunge notevoli vantaggi in termini di determinazione dell’identità delle molecole. Nel seguente video è possibile seguire gli ioni nel loro cammino nel caso di un esperimento LC-MS/MS

Dal sito Bruker è possibile vedere come funziona un MALDI-TOF-TOF e da quello dell’Agilent come funziona un triplo quadrupolo associato ad un gas cromatografo o ad un HPLC/UPLC.

Le tecniche di HR-MS e MS/MS (o tandem MS) hanno notevolmente contribuito all’applicazione odierna di questa tecnica in campo metabolomico.
Inoltre, non va dimenticata la possibilità offerta dalle tecniche di imaging da un lato e dall’applicazione di tecnologie ancora più avanzate dall’altro.
Come non menzionare, allora, l’utilizzo della ion mobility mass spectrometry, che separa gli ioni non solo in base al rapporto massa/carica ma anche in funzione della loro grandezza e forma.

Le più recenti applicazioni della spettrometria di massa in metabolomica sono state trattate in una review recente “Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites” (Ren at al., RSC Advances, 2018).