Chimica Organica-DiSTABiF

La metabolomica è una disciplina che studia l’insieme completo dei metaboliti presenti in un sistema biologico, come cellule, tessuti o organismi. Questa scienza rappresenta un’evoluzione delle scienze “omiche”, quali genomica, trascrittomica e proteomica, ed è particolarmente rilevante nell’ambito della biologia dei sistemi. Grazie all’integrazione di tecniche analitiche avanzate, come la spettrometria di massa (MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR), la metabolomica offre una visione globale e dettagliata del metabolismo cellulare.

Biologia dei Sistemi e il Ruolo della Metabolomica
La biologia dei sistemi è un approccio olistico che cerca di comprendere le interazioni complesse tra i vari componenti di un sistema biologico, dai livelli molecolari fino all’intero organismo. Essa si basa sull’idea che “il tutto è maggiore della somma delle sue parti”, e si avvale di modelli computazionali e matematici per descrivere tali interazioni. In questo contesto, la metabolomica fornisce informazioni chiave sullo stato funzionale delle cellule, evidenziando le attività metaboliche attuali e i cambiamenti indotti da stimoli esterni.
I metaboliti offrono una visione immediata di ciò che sta accadendo in un dato momento, completando le informazioni derivanti da DNA (ciò che è possibile), RNA (ciò che sembra stia accadendo) e proteine (ciò che lo rende possibile).

Applicazioni della Metabolomica

L’immagine illustra le principali applicazioni della metabolomica in biologia (pur non essendo esaustiva), suddivise in diversi ambiti tematici.

1. Chimica dei prodotti naturali
   La metabolomica viene utilizzata per analizzare i prodotti naturali, come alcaloidi, flavonoidi o terpeni. Questi composti trovano applicazione in ambito farmaceutico, agricolo e in molte altre scienze.
2. Risposta agli stress
   Studia come gli organismi viventi (ad esempio piante o animali) rispondono agli stress biotici (virus, batteri, funghi) e abiotici (temperatura, salinità, metalli pesanti). Questo è cruciale, ad esempio, per sviluppare colture più resistenti o per comprendere i meccanismi di adattamento.
3. Fisiologia
   L’analisi metabolomica consente di esaminare i processi fisiologici, come la fotosintesi, la respirazione e la biosintesi di carboidrati o lipidi, migliorando la comprensione del metabolismo nelle piante e in altri organismi.
4. Interazioni tra organismi
   Analizza le interazioni tra organismi, come la simbiosi, il parassitismo o la competizione, studiando i metaboliti scambiati o prodotti durante questi processi.
5. Tassonomia
   Permette di classificare gli organismi in base ai loro profili metabolici unici, fornendo un approccio complementare alla genetica e alla morfologia per la classificazione tassonomica.
6. Scienza degli alimenti
   La metabolomica è impiegata per studiare la composizione nutrizionale degli alimenti, la loro qualità, la sicurezza e le trasformazioni chimiche che avvengono durante la lavorazione o la conservazione.
7. Ricerca farmaceutica
   Aiuta nello sviluppo di nuovi farmaci identificando metaboliti bioattivi e nel comprendere meglio i meccanismi d’azione di farmaci già esistenti.
8. Biologia e chimica microbica
   Studia il metabolismo dei microrganismi per applicazioni come la produzione di antibiotici, enzimi o composti bioattivi.
9. Metabolismo umano e biomarcatori
   Questa categoria comprende l’identificazione di biomarcatori utili per diagnosticare malattie, monitorare la salute e sviluppare terapie personalizzate in ambito medico.
10. Scienza ambientale
    Analizza l’impatto dell’ambiente sui metaboliti, ad esempio studiando il bioaccumulo di contaminanti o le interazioni chimiche tra organismi e fattori ambientali.

La metabolomica trova, dunque, applicazione in diversi ambiti della biologia e delle scienze applicate:
• Chimica delle sostanze naturali: identificazione di composti bioattivi da fonti naturali, utili per lo sviluppo di farmaci e non solo.
Il processo classico di identificazione dei prodotti naturali è stato storicamente lungo e dispendioso in termini di risorse. Un esempio pratico è lo studio condotto su Astragalus boeticus, in cui l’astragaloside è stato identificato come un candidato promettente per applicazioni farmacologiche. Questo composto ha mostrato una selettività specifica contro linee cellulari resistenti ai farmaci, rendendolo un punto di partenza per ulteriori studi preclinici. Grazie all’integrazione della metabolomica, il processo di screening è stato ottimizzato, riducendo significativamente il tempo necessario per identificare tali bioattivi. La metabolomica, combinando analisi qualitative e quantitative simultanee di un ampio numero di metaboliti, accelera significativamente questa ricerca, consentendo di individuare rapidamente candidati promettenti per applicazioni terapeutiche.
• Analisi Funzionale e Annotazione dei Metaboliti
Un’altra area di interesse è l’annotazione funzionale dei metaboliti, ossia l’assegnazione di funzioni biologiche specifiche ai composti chimici identificati. Questo approccio è cruciale per comprendere i ruoli fisiologici dei metaboliti e le loro interazioni nei sistemi biologici.
• Chemotassonomia: classificazione degli organismi basata sulle loro caratteristiche biochimiche. Questa metodologia è applicata per distinguere specie di piante attraverso l’analisi dei loro metaboliti specializzati.
• Scienze alimentari: analisi della composizione chimica degli alimenti per migliorarne qualità e sicurezza. La metabolomica consente, ad esempio, di monitorare cambiamenti nei metaboliti durante i processi di trasformazione alimentare.
• Ricerca farmacologica: scoperta di nuovi biomarcatori e terapie mirate per malattie umane. L’identificazione di composti bioattivi attraverso approcci metabolomici offre nuove opportunità per la terapia personalizzata.
• Medicina: applicazioni in questo ambito includono tutti gli aspetti che riguardano la diagnosi precoce di malattie (es. cancro), permettendo l’identificazione di specifici biomarcatori. I biomarcatori possono essere utili anche per differenziare sottotipi di malattie apparentemente simili, migliorando la precisione diagnostica. Inoltre, l’analisi dei profili metabolici può essere utilizzata per valutare l’efficacia di trattamenti medici e personalizzarli. Grazie alla metabolomica, è possibile anche adattare i trattamenti in base al profilo metabolico individuale del paziente (medicina personalizzata). È inoltre possibile, analizzando il metabolismo alterato in pazienti con specifiche patologie, comprendere i meccanismi alla base di malattie complesse.
• Risposta allo stress: studio dei meccanismi di adattamento delle piante a condizioni avverse.
• Ecologia e Studio delle Interazioni Biologiche: la metabolomica permette di approfondire lo studio delle interazioni tra organismi. In particolare:

• Interazioni pianta-pianta: Un esempio pratico è rappresentato dagli studi sull’allelopatia, in cui estratti di piante donatrici come Arbutus unedo e Myrtus communis sono stati testati per valutare i loro effetti sulla crescita e sul metabolismo di specie riceventi come Medicago minima. Questi esperimenti hanno evidenziato una riduzione significativa della crescita delle piante riceventi, indicando la presenza di composti allelopatici attivi.
• Interazioni pianta-microrganismi: La metabolomica permette, ad esempio, di rilevare metaboliti chiave coinvolti nella simbiosi tra piante e microbi benefici.
• Interazioni pianta-animale: La metabolomica può, ad esempio, essere usata per studiare composti volatili che le piante rilasciano in risposta all’attacco da parte di insetti erbivori, modulando il comportamento di predatori naturali degli insetti stessi e rafforzando le difese delle piante.
  

Limiti e Sfide della Metabolomica

Nonostante i progressi, la metabolomica presenta alcune limitazioni. Ad esempio, nella stima dei flussi metabolici (fluxomics), una sfida significativa è rappresentata dalla complessità delle reti metaboliche. L’uso di isotopi marcati consente di monitorare i flussi metabolici attraverso esperimenti di labelling, ma l’interpretazione dei dati è complicata da fenomeni come i cicli futili e l’alto grado di interconnessione tra i pathway metabolici. Un esempio pratico riguarda l’analisi dei flussi in percorsi biosintetici lineari, dove l’equilibrio tra gli input e gli output può essere calcolato solo in condizioni sperimentali rigorosamente controllate.

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La metabolomica è una disciplina cardine nella biologia moderna, con il potenziale di rivoluzionare la nostra comprensione dei sistemi biologici. Grazie alla sua capacità di fornire una visione globale e dettagliata del metabolismo, questa scienza continuerà a contribuire significativamente a molteplici settori della ricerca e delle applicazioni in diversi ambiti.

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Utilizzando il seguente link, è possibile scaricare le slide dell’ultima lezione: https://www.dropbox.com/scl/fi/xjkdhspx3qirtqb61ikmu/11.-Metabolomica-in-biologia.pdf?rlkey=w3p94cto02mxinwi9yhmi6zez&st=b8xoyyjn&dl=0

Nel contesto della metabolomica, gli approcci di analisi statistica più comuni si suddividono in metodi univariati e multivariati. Ogni metodo offre approfondimenti unici sulla struttura dei dati. L’analisi multivariata opera su una matrice di variabili e mette in evidenza le caratteristiche basandosi sulle relazioni tra tutte le variabili. L’analisi univariata considera invece una sola variabile alla volta, producendo risultati ponderati in modo diverso.

L’obiettivo dell’analisi statistica è la categorizzazione e la previsione delle proprietà dei campioni attraverso la generazione di modelli che catturano le informazioni contenute nelle matrici di dati. Nella spettrometria di massa, il rapporto m/z e l’intensità del segnale sono le due variabili più importanti. Nell’NMR selezioniamo i segnali integrati di interesse per l’analisi dei dati.

Nell’ambito dell’analisi multivariata, distinguiamo metodi supervised e unsupervised come i due principali approcci di analisi statistica e machine learning utilizzati per analizzare i dati.

Metodi Unsupervised

I metodi unsupervised non richiedono etichette o variabili di output predefinite. L’obiettivo è esplorare la struttura intrinseca dei dati, trovando pattern, gruppi o caratteristiche rilevanti.

Caratteristiche principali:

• No etichette: Non esistono etichette a priori; i metodi cercano di individuare somiglianze o differenze nei dati.
• Scoperta di pattern: Sono utilizzati per esplorare i dati e identificare raggruppamenti naturali o ridurre la dimensionalità.
• Esempi di metodi unsupervised:
  • Clustering: Algoritmi come Hierarchical Clustering dividono i dati in gruppi basati su similarità.
  • Riduzione della dimensionalità: Metodi come PCA (Principal Component Analysis) semplificano la rappresentazione dei dati preservandone le caratteristiche principali.

Metodi Supervised

I metodi supervised richiedono un set di dati etichettati, in cui ogni campione è associato a un’etichetta o a una variabile di output nota (ad esempio, classe, valore numerico, ecc.). L’obiettivo principale è costruire un modello che sia in grado di prevedere accuratamente l’etichetta per nuovi dati non etichettati.

Caratteristiche principali:

• Training su dati etichettati: Si utilizza un insieme di dati noti (training set) per apprendere la relazione tra le variabili indipendenti (input) e le etichette (output).
• Predizione: Una volta addestrato, il modello può essere utilizzato per prevedere le etichette di nuovi campioni.
• Esempi di metodi supervised in metabolomica: PLS-DA (Partial Least Square – DIscriminant Analysis)

Analisi delle Componenti Principali (PCA)

L’Analisi delle Componenti Principali (PCA, Principal Component Analysis) è una tecnica di riduzione della dimensionalità utilizzata per semplificare set di dati complessi preservandone le caratteristiche più rilevanti. È ampiamente impiegata in numerosi campi, come la metabolomica, la genetica, l’analisi di immagini, e altre discipline che gestiscono dati ad alta dimensionalità.

Obiettivo della PCA

La PCA mira a trasformare un set di dati originale (caratterizzato da molte variabili correlate) in un nuovo sistema di coordinate, chiamato componenti principali. Queste componenti:

1. Sono ortogonali (non correlate tra loro).
2. Catturano la varianza massima: la prima componente principale (PC1) cattura la maggior parte della varianza nei dati, seguita dalla seconda (PC2), e così via.

Questo processo consente di rappresentare i dati con un numero inferiore di variabili, riducendo la complessità ma mantenendo la maggior parte dell’informazione.
Come vengono calcolate le componenti principali? Vedi il materiale presente al link “DATA ANALYSIS” sotto per io dettagli. Fondamentalmente, si scelgono le componenti principali che spiegano una frazione significativa della varianza totale (ad esempio, il 95%) e i dati originali vengono trasformati nel nuovo sistema di coordinate formato dalle componenti principali.

Grafici principali nella PCA

1. Score Plot

Lo score plot mostra la proiezione dei campioni nello spazio delle componenti principali selezionate (ad esempio, PC1 e PC2).

• Cosa rappresenta:
  • Ogni punto nel grafico corrisponde a un campione nel dataset.
  • Le coordinate di un campione sul grafico rappresentano i suoi punteggi (scores), ovvero i valori proiettati sulle componenti principali.
• Utilità:
  • Identifica pattern nei dati: ad esempio, raggruppamenti naturali, tendenze, o separazioni tra gruppi (es. malati vs sani).
  • Aiuta a rilevare outlier o campioni anomali.
• Esempio:
  • Un gruppo di campioni che si aggregano in una regione dello score plot può indicare una similarità tra di essi (ad esempio, appartenenza a una stessa classe).

2. Loading Plot

Il loading plot rappresenta i carichi (loadings), ovvero i coefficienti che descrivono il contributo delle variabili originali (metaboliti, geni, ecc.) alle componenti principali.

In uno studio metabolomico, un loading plot potrebbe evidenziare quali metaboliti sono responsabili della separazione tra gruppi di campioni osservata nello score plot.

Cosa rappresenta:

Ogni punto nel grafico corrisponde a una variabile originale. La posizione di una variabile indica quanto questa contribuisce a ciascuna componente principale.

Un loading plot sotto forma di istogramma è una rappresentazione alternativa dei carichi (loadings) che descrivono il contributo delle variabili originali (ad esempio, metaboliti, geni, segnali) a una specifica componente principale (PC). Invece di visualizzare i carichi come punti o vettori su un piano cartesiano (come accade nel loading plot tradizionale), in un istogramma ogni barra rappresenta il peso di una variabile su una determinata componente principale.

Caratteristiche del Loading Plot a Istogramma

• Asse X:
  • Rappresenta le variabili originali (es. nomi o numeri che identificano i metaboliti, geni, o segnali di interesse).
  • Ogni barra corrisponde a una variabile.
• Asse Y:
  • Indica il valore del carico (loading), che può essere positivo o negativo.
  • I valori positivi mostrano una correlazione diretta con la componente principale, mentre i valori negativi indicano una correlazione inversa.
• Altezza delle barre:
  • La lunghezza di ciascuna barra rappresenta il contributo della variabile alla specifica componente principale.
  • Variabili con barre più alte (in valore assoluto) hanno un’influenza maggiore sulla componente.

Utilità:

Identifica le variabili che influenzano maggiormente le componenti principali. Aiuta a interpretare la biologia o il fenomeno dietro ai pattern osservati nello score plot. Rileva correlazioni tra variabili: variabili vicine o nella stessa direzione possono essere correlate, mentre quelle opposte possono essere anti-correlate.

Qui potete scaricare il materiale utile allo studio dell’analisi dei dati di metabolomica: DATA ANALYSIS

Una volta ottenute le variabili significative, dovremo capire quali metaboliti si “nascondono” dietro queste variabili, ad esempio, analizzando i dati NMR.

NB: L’analisi metabolomica prevede vari step e ognuno di questi porta con se una certa variabilità.
La standardizzazione delle procedure analitiche, di analisi e presentazione dei dati è di fondamentale importanza per poter “parlare” un linguaggio comune che permetta di confrontare i risultati di esperimenti diversi.

Sul sito della Metabolomics Society, alla pagina dedicata, è possibile leggere informazioni importanti su questo punto. La pagina riporta anche una serie di link a progetti e pubblicazioni.

Oltre a quelle riportate sul sito, vi consiglio anche i “Proposed minimum reporting standards for chemical analysis” e “for data analysis” e l’articolo “Metabolite identification: are you sure? And how do your peers gauge your confidence?”

Una delle tecniche utilizzate in metabolomica è la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Questo sarà l’approccio che utilizzeremo nel corso dell’attività di laboratorio

Questa tecnica, che si basa sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni isotopi, ha tantissime applicazioni ed è certamente insostituibile quando si parla di caratterizzazione di composti organici. In questo contesto, ricordiamo che tra i nuclei attivi all’NMR ci sono l’idrogeno (¹H) e il carbonio 13 (¹³C). La scarsa abbondanza naturale del ¹³C, insieme ad altre caratteristiche di questo nucleo, fanno sì che nel caso della metabolomica sia molto più pratico lavorare con ¹H-NMR.

Dall’analisi NMR di un campione si possono dedurre tante informazioni diverse. Ma come si effettua un’analisi metabolomica mediante NMR?

A partire dal materiale liofilizzato, si ottengono gli estratti con una procedura molto semplice che prevede l’estrazione diretta in solventi deuterati (necessari per l’analisi NMR). Questi estratti vengono analizzati, ottenendo gli spettri, che saranno poi processati: questo processing prevede l’apodizzazione, la fasatura, la calibrazione rispetto allo standard intetno e la correzione della linea di base

A questo punto si procede con l’integrazione. Questa è effettuata attraverso il processo di bucketing o binnig: lo spettro si divide in tanti segmenti di lunghezza definita (in genere 0.02 o 0.04 ppm) e si procede ad integrare l’area sotto la curva di ogni bucket. Si ottiene in questo modo una matrice di dati in cui le osservazioni sono i singoli campioni analizzati e le variabili sono i vari bucket, che assumeranno quindi il valore dell’area per quella parte dello spettro in ciascun campione (NB: le aree sono in genere normalizzate rispetto allo standard interno a alla total intensity).

La matrice di dati così ottenuta è sottoposta ad analisi statistica multivariata. Questa sarà utile ad estrarre le informazioni significative dal nostro set di dati.

Una volta identificati i segnali NMR significativi per la nostra analisi, è necessario “tradurre” questi segnali in metaboliti. Si opera a questo punto per step successivi.
Il primo passaggio è quello del confronto con la letteratura e con i database. A questo proposito, è necessario sottolineare come l’NMR sia una metodica altamente riproducibile. In ogni caso, se questa ricerca non ci dà la risposta sperata, si può optare per l’analisi NMR bidimensionale (2D NMR).I metodi 2D NMR più utilizzati in metabolomica sono brevemente descritti di seguito.

COSY (COrrelation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare correlazioni omonucleari ¹H-¹H tra protoni vicinali e geminali

TOCSY (TOtal Correlation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin (il trasferimento di magnetizzazione è interrotto da carboni quaternari).

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni dirette protone-carbonio. Permette quindi di attribuire il valore di chemical shift del carbonio per ciascun carbonio protonato presente nell’estratto (o nella molecola, quando lo spettro si riferisce ad un composto puro)

H2BC (Heteronuclear 2 bond correlation)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e il carboni vicinale, a patto che quest’ultimo sia protonato.

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e carboni distanti due, tre o quattro legami. Un esperimento alternativo è noto come CIGAR-HMBC.

HSQC-TOCSY

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin, che in questo caso includono sia i protoni sia i carboni.

Grazie alla combinazione delle informazioni che si ottengono dai diversi spettri 2D NMR, è possibile identificare i costituenti dell’estratto anche in miscela. Per metaboliti già noti, a questo punto sarà possibile confrontare i dati NMR con quelli riportati in letteratura o con quelli degli standard (a patto che siano acquisiti nello stesso solvente). Per i composti identificati per la prima volta, al fine di confermare la struttura, saranno necessari l’isolamento (che a questo punto sarà facilitato dalle informazioni preliminari in nostro possesso circa la struttura del composto) e la completa caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche.
Va infine ricordato che oltre ad identificare i componenti dell’estratto, è anche possibile quantificarli dato che l’ ¹H NMR è una tecnica quantitativa (se gli spettri sono acquisiti con determinati parametri) e che è sufficiente in questo caso utilizzare uno standard interno a concentrazione nota.

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che non ha rivali nell’ambito della caratterizzazione strutturale. Questa tecnica spettroscopica, che sfrutta le proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi, ci permette di avere informazioni fondamentali sui composti organici. Non tutti i nuclei sono attivi all’NMR, ma tra quelli attivi si annoverano il protone e l’isotopo ¹³C del carbonio ed è proprio grazie all’applicazione a questi nuclei che otteniamo informazioni strutturali fondamentali per poter identificare la struttura dei composti.

Da uno spettro protonico possiamo dedurre numerose informazioni: il chemical shift ci dà informazioni su quello che è l’intorno chimico, la molteplicità ci dà informazioni sul numero di protoni legati ai carboni vicini (con le costanti di accoppiamento che ci forniscono altre importanti informazioni strutturali), infine l’integrazione ci permette di avere informazioni di tipo quantitativo.
L’utilizzo di techinche 2D-NMR, inoltre, ci dà la possibilità di ricostruire l’intero scheletro delle molecole.
Tutte queste potenzialità sono estremamente utili in metabolomica. Abbiamo visto (e vedremo) in che modo possiamo applicare questa tecnica all’analisi metabolomica.

Intanto, cerchiamo di capire meglio il principio di base su cui poggia questa potentissima tecnicha.
Di seguito, due video che possono aiutarci. Il primo, prodotto dalla Bruker, il secondo da Sciencesketch.

Curiosi anche di sapere come è fatto lo strumento all’interno? Date un’occhiata qui!

Al link seguente è possibile scaricare il materiale di supporto allo studio:

Testi utili per ulteriori approfondimenti:

-D’Ischia “La chimica organica in laboratorio” Ed. Piccin
-Hesse “Metodi Spettroscopici in Chimica Organica”

(entrambi disponibili in biblioteca; in caso di indisponibilità, rivolgersi alla docente)

Le due tecniche più utilizzate ad oggi per acquisire i dati in metabolomica sono senza dubbio la spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risononanza magnetica nucleare (NMR).
La prima sfrutta la possibilità di generare e separare ioni in base al loro rapporto massa/carica. A lezione abbiamo visto che in realtà esistono tantissime applicazioni (ed “evoluzioni”) diverse di questa tecnica che la rendono particolarmente utile nell’analisi metabolomica. Il video seguente illustra, invece, il principio di base.

In una serie di video proposti dalla Waters, è possibile capire più a fondo il principio di funzionamente dell’ESI (Elettrospray ionization), che abbiamo visto essere insieme all’APCI e al MALDI (con tutte le variazioni sul tema viste a lezione) una delle tecniche di ionizzazione più diffuse quando la MS è utilizzata in metabolomica. Per quanto riguarda gli analizzatori, è possibile vedere come è fatto un quadrupolo.
Inoltre, è possibile approfondire la problematica della formazione di addotti, della formazione di specie con carica multipla, nonchè la questione dei picchi isotopici. Infine, viene affrontata la questione importantissima della risoluzione.

L’alta risoluzione è, in effetti, fondamentale nell’analisi metabolomica e, come abbiamo visto, anche l’applicazione della MS/MS aggiunge notevoli vantaggi in termini di determinazione dell’identità delle molecole. Nel seguente video è possibile seguire gli ioni nel loro cammino nel caso di un esperimento LC-MS/MS

Dal sito Bruker è possibile vedere come funziona un MALDI-TOF-TOF e da quello dell’Agilent come funziona un triplo quadrupolo associato ad un gas cromatografo o ad un HPLC/UPLC.

Le tecniche di HR-MS e MS/MS (o tandem MS) hanno notevolmente contribuito all’applicazione odierna di questa tecnica in campo metabolomico.
Inoltre, non va dimenticata la possibilità offerta dalle tecniche di imaging da un lato e dall’applicazione di tecnologie ancora più avanzate dall’altro.
Come non menzionare, allora, l’utilizzo della ion mobility mass spectrometry, che separa gli ioni non solo in base al rapporto massa/carica ma anche in funzione della loro grandezza e forma.

Le più recenti applicazioni della spettrometria di massa in metabolomica sono state trattate in una review recente “Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites” (Ren at al., RSC Advances, 2018).

Al link seguente è possibile scaricare il materiale di supporto allo studio:

Le tecniche cromatografiche rivestono un ruolo cruciale nell’analisi metabolomica.

Qui potrete scaricare le slide delle lezioni relative a queste tecniche.

Invece qui potete scaricare del materiale per lo studio.

Infine, di seguito troverete alcuni video e animazioni che possono aiutarvi a visualizzare meglio alcune delle tecniche introdotte al corso.

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

HPLC

GC

Che cos’è la metabolomica? Come si colloca nell’ambito della biologia dei sistemi? Quali sono le possibili applicazioni? Qual è la tipica sequenza sperimentale di un approccio metabolomico? Questi sono alcuni dei punti trattati nel corso della prima lezione.

Metabolomica: un approccio all’interfaccia tra la chimica e la biologia

La METABOLOMICA è un approccio innovativo allo studio dei fenomeni e dei sistemi biologici.

Innanzitutto, dobbiamo considerare l’ampio range di applicazioni di questo approccio allo studio dei sistemi biologici. Applicazioni che riguardano la chimica delle sostanze naturali, la chimica degli alimenti, la chimica farmaceutica, il metabolismo, la fisiologia e lo studio della risposta a stress da parte degli organismi e delle interazioni che tra essi intercorrono, la chimica ambientale, la ricerca biomedica e tantissimi altri campi.

Del resto, la metabolomica si colloca all’interfaccia tra la chimica e la biologia, in quanto ciascun fenomeno biologico produrrà una risposta chimica misurabile e la determinazione delle variazioni osservate fornirà informazioni sullo stato del sistema biologico in analisi. Inoltre, andando a misurare quelli che sono i prodotti finali dell’espressione genica, ossia i metaboliti, fornisce informazioni essenziali su quello che è il fenotipo e la relazione di quest’ultimo col genotipo.

Uno step fondamentale nell’approccio metabolomico è la fase di disegno sperimentale. Al fine di ottenere dati che siano statisticamente e biologicamente significativi e che diano risposta alla nostra research question, è necessario definire a priori tutti i parametri sperimentali da considerare, le variabili da valutare e quelle da controllare. Sarà necessario inoltre prendere in considerazione l’utilizzo di un numero opportuno di replicati tecnici e biologici (tale numero varia sia in base al sistema biologico in analisi, sia in base alle tecniche analitiche utilizzate).

A questo punto, sarà necessario procedere all’esecuzione dell’esperimento e/o al campionamento. Le metodiche utilizzate variano a seconda del tipo di campione, ma un punto fondamentale e ineludibile, al fine di ottenere risultati che rispecchino il reale stato del sistema, è il quenching del metabolismo: sarà necessario bloccare tutte le reazioni, siano esse catalizzate da enzimi o meno. In genere, questo si ottiene con il metodo del deep freezing, congelando il campione immediatamente in azoto liquido (-196°C). I campioni sono poi conservati a -80°C fino al momento della liofilizzazione. Quest’ultimo processo, che allontana l’acqua dal campione, è necessario sia per una migliore conservazione (l’acqua è il mezzo per la maggior parte delle reazioni che avvengono nei campioni biologici) sia (in alcuni casi) per rendere compatibile il campione con le successive analisi.

La maggior parte delle tecniche analitiche usate in metabolomica richiede che il campione sia in soluzione, di conseguenza il passaggio successivo consisterà in una procedura di estrazione dei metaboliti. In questo caso le metodiche variano sia in base alla natura del campione, sia in base alla piattaforma analitica che si utilizzerà nella fase successiva. Fase successiva che consiste nell’analisi della composizione chimica degli estratti. Diverse tecniche sono disponibili, ma quelle più comunemente utilizzate in metabolomica sono la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e la Spettrometria di Massa (MS). Quest’ultima richiede solitamente una separazione a monte dei metaboliti che compongono l’estratto ed è quindi in genere interfacciata con un sistema cromatografico (GC o HPLC/UPLC).

Una volta acquisiti i dati, il complesso dataset ottenuto è analizzato attraverso metodiche di analisi statistica multivariata (MVDA) al fine di estrarre le informazioni circa la classificazione dei campioni e circa i segnali e, in ultima analisi, i composti responsabili della classificazione osservata. A questo punto, si procede con la caratterizzazione strutturale dei composti che risultano essere significativi nell’analisi. Questa caratterizzazione si avvale, tra l’altro, di tecniche ad alta risoluzione e di spettrometria tandem, nel caso della MS. Nel caso dell’NMR una caratterizzazione dei metaboliti nell’estratto è possibile mediante l’utilizzo di tecniche NMR bidimensionali. Per entrambe le tecniche, un supporto notevole è fornito dai database.

Le informazioni estrapolate mediante MVDA vanno poi integrate con le conoscenze sul sistema biologico in analisi e forniranno la risposta alla domanda che sottende lo studio o forniranno nuove ipotesi da testare.

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Al seguente link è possibile scaricare le slide del corso, insieme a del materiale utile per approfondimenti.

Inolre, è possibile ottenere informazioni anche al seguente link: Introduzione alla metabolomica (contenuti: definizione di metaboloma e metabolomica, note sull’importanza di questo tipo di approccio e campi di applicazione, panoramica di quello che è l’approccio dal punto di vista metodologico).

E alla fine potrai anche testare le tue conoscenze