NMR-based metabolomics

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Una delle tecniche utilizzate in metabolomica è la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Questo sarà l’approccio che utilizzeremo nel corso dell’attività di laboratorio

Questa tecnica, che si basa sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni isotopi, ha tantissime applicazioni ed è certamente insostituibile quando si parla di caratterizzazione di composti organici. In questo contesto, ricordiamo che tra i nuclei attivi all’NMR ci sono l’idrogeno (1H) e il carbonio 13 (13C). La scarsa abbondanza naturale del 13C, insieme ad altre caratteristiche di questo nucleo, fanno sì che nel caso della metabolomica sia molto più pratico lavorare con 1H-NMR.

Dall’analisi NMR di un campione si possono dedurre tante informazioni diverse. Ma come si effettua un’analisi metabolomica mediante NMR?

A partire dal materiale liofilizzato, si ottengono gli estratti con una procedura molto semplice che prevede l’estrazione diretta in solventi deuterati (necessari per l’analisi NMR). Questi estratti vengono analizzati, ottenendo gli spettri, che saranno poi processati: questo processing prevede l’apodizzazione, la fasatura, la calibrazione rispetto allo standard intetno e la correzione della linea di base

A questo punto si procede con l’integrazione. Questa è effettuata attraverso il processo di bucketing o binnig: lo spettro si divide in tanti segmenti di lunghezza definita (in genere 0.02 o 0.04 ppm) e si procede ad integrare l’area sotto la curva di ogni bucket. Si ottiene in questo modo una matrice di dati in cui le osservazioni sono i singoli campioni analizzati e le variabili sono i vari bucket, che assumeranno quindi il valore dell’area per quella parte dello spettro in ciascun campione (NB: le aree sono in genere normalizzate rispetto allo standard interno a alla total intensity).

La matrice di dati così ottenuta è sottoposta ad analisi statistica multivariata. Questa sarà utile ad estrarre le informazioni significative dal nostro set di dati.

Una volta identificati i segnali NMR significativi per la nostra analisi, è necessario “tradurre” questi segnali in metaboliti. Si opera a questo punto per step successivi.
Il primo passaggio è quello del confronto con la letteratura e con i database. A questo proposito, è necessario sottolineare come l’NMR sia una metodica altamente riproducibile. In ogni caso, se questa ricerca non ci dà la risposta sperata, si può optare per l’analisi NMR bidimensionale (2D NMR).I metodi 2D NMR più utilizzati in metabolomica sono brevemente descritti di seguito.

COSY (COrrelation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare correlazioni omonucleari 1H-1H tra protoni vicinali e geminali

TOCSY (TOtal Correlation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin (il trasferimento di magnetizzazione è interrotto da carboni quaternari).

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni dirette protone-carbonio. Permette quindi di attribuire il valore di chemical shift del carbonio per ciascun carbonio protonato presente nell’estratto (o nella molecola, quando lo spettro si riferisce ad un composto puro)

H2BC (Heteronuclear 2 bond correlation)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e il carboni vicinale, a patto che quest’ultimo sia protonato.

Correlazioni selezionate indicate sullo spettro e sulla struttura con lo stesso colore

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e carboni distanti due, tre o quattro legami. Un esperimento alternativo è noto come CIGAR-HMBC.

Sono evidenziate le correlazioni del composto mostrato in alto a sinistra. Le altre correlazioni appartengono ad altre componenti dell’estratto.

HSQC-TOCSY

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin, che in questo caso includono sia i protoni sia i carboni.

Grazie alla combinazione delle informazioni che si ottengono dai diversi spettri 2D NMR, è possibile identificare i costituenti dell’estratto anche in miscela. Per metaboliti già noti, a questo punto sarà possibile confrontare i dati NMR con quelli riportati in letteratura o con quelli degli standard (a patto che siano acquisiti nello stesso solvente). Per i composti identificati per la prima volta, al fine di confermare la struttura, saranno necessari l’isolamento (che a questo punto sarà facilitato dalle informazioni preliminari in nostro possesso circa la struttura del composto) e la completa caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche.
Va infine ricordato che oltre ad identificare i componenti dell’estratto, è anche possibile quantificarli dato che l’ 1H NMR è una tecnica quantitativa (se gli spettri sono acquisiti con determinati parametri) e che è sufficiente in questo caso utilizzare uno standard interno a concentrazione nota.

Esercitiamoci per la IV Prova

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Suggerimento: per poter usare questi set di esercizi come test di autovalutazione, svolgerli senza l’ausilio di libro/appunti ed impiegando un tempo massimo di 2 ore per ciascun set.

PRIMO SET

1) Mostrare le condizioni di reazione, il meccanismo e i prodotti della reazione del propanone con azaciclopentano     

2) Mostrare le condizioni di reazione e il meccanismo per ottenere l’acido propanoico a partire dall’opportuno estere                 

3) Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazione o i prodotti mancanti nei riquadri. Evidenziare la stereochimica quando opportuno.

4) Scrivere i prodotti delle seguenti reazioni: 

5) Indicare le condizioni di reazione ottimali per ottenere le seguenti trasformazioni:             

6) Ordina i seguenti composti per reattività crescente in una reazione E1        

7) Chi reagirà più velocemente in una reazione E2 tra (1S,3R)-1-bromo-3-isopropilcicloesano e (1S,3S)-1-bromo-3-isopropilcicloesano? Spiegare sinteticamente perché               

8) Assegnare il nome IUPAC, comprensivo di stereochimica, ai seguenti composti        

SECONDO SET

  1) Assegnare il nome IUPAC ai seguenti composti              

                                               

2) Mostrare le condizioni di reazione, il meccanismo e i prodotti della reazione del 3-pentanone con metanolo 

3) Come sintetizzeresti il seguente composto a partire da un composto carbonilico ed un’ammina?        

4) Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazione o i prodotti mancanti nei riquadri. Indicare la stereochimica quando opportuno.

5) Scrivere i prodotti delle seguenti reazioni: 

6) Indicare le condizioni di reazione ottimali per ottenere le seguenti trasformazioni: 

6) Ordina i seguenti composti per reattività crescente in una reazione E2   

7) Il prodotto di eliminazione E2 di (1R,2S)-1-bromo-2-isopropilcicloesano sarà diverso dal prodotto di eliminazione di (1S,3S)-1-bromo-2-isopropilcicloesano. Spiegare sinteticamente perché                                   

TERZO SET

1) Qual è il prodotto della seguente reazione?

2) Completare il seguente schema inserendo i prodotti

3) Indicare le condizioni di reazione:

4) Spiegare perchè nella seguente reazione non si ottiene alcun prodotto di eliminazione

5) Mostrare il meccanismo e i prodotti della reazione del ciclopentanone con etanolo in ambiente acido.           

6) Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazione o i prodotti mancanti nei riquadri. Indicare la stereochimica quando opportuno.                                                                         

7) Mostrare il meccanismo di idrolisi in condizioni basiche di un estere (utilizzare R- per indicare la catena alchilica)

8) Assegnare il nome IUPAC al seguente composto     

                                                                                                                              

Esercitazione su reazioni dei composti carbonilici

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1) Come si potrebbero sintetizzare i seguenti composti mediante una reazione tra un aldeide o un chetone e un reattivo di Grignard?

a) 2-pentanolo
b) 1-butanolo
c) 1-fenilcicloesan-1-olo
Mostrare i meccanismi di reazione

2) Trattando l’aldeide 4-idrossibutanale con metanolo in presenza di un catalizzatore acido (HCl), si ottiene il 2-metossitetraidrofurano (la cui struttura è qui riportata). Proporre un meccanismo per la reazione.

3) (R)-carvone è il principale componente dell’essenza di menta. Quali sono i prodotti attesi dalla reazione del carvone con i seguenti reagenti? a) HOCH2CH2OH, HCl; b) metanammina; c) 2 equivalenti H2, Pd/C; d) litio alluminio idruro, poi H3O+, e) bromuro di etilmagnesio, poi H3O+.

4) Il carbonio carbonilico del propanale viene attaccato dallo ione cianuro. Quale saranno gli orbitali HOMO e LUMO coinvolti nella reazione?

5) Mostrare le condizioni di reazione, il meccanismo e indicare i prodotti delle seguenti reazioni. Classificare i prodotti come immine o enammine

6) Spiegare perchè delle due reazioni mostrate in basso la prima avviene velocemente e la seconda non avviene

7) Quale composto carbonilico e quale alcol sono necessari per sintetizzare i seguenti composti?

8) Mostrare i prodotti ottenuti a partire dai seguenti composti posti in presenza di tracce di acido

9) Mostrare il meccanismo e scrivere il prodotto della seguente reazione

10) Proporre il meccanismo di idrolisi del composto formato nell’esercizio 9

11) Completare il seguente schema:

12. Scrivere i prodotti delle seguenti reazioni: 

13) Come si potrebbe convertire l’acido butanoico nei seguenti composti?
a) 1-butanolo
b)1-bromobutano
c) acido pentanoico
d) 1-butene
Le trasformazioni potrebbero richiedere più passaggi.
Mostrare i meccanismi di reazione

14) Il paracetamolo, N-(4-idrossifenil)acetammide, è un farmaco ad azione analgesica ed antipiretica molto utilizzato. Tachipirina ed Efferalgan sono i nomi commerciali più conosciuti dei farmaci che lo contengono. il paracetamolo può essere preparato per acetilazione selettiva del gruppo amminico del 4-amminofenolo con anidride acetica in H2O (vedi figura). Proporre il meccanismo di reazione utilizzato nella sintesi del paracetamolo a partire dal 4-amminofenolo

15) Completare il seguente schema:

16) Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazione o i prodotti mancanti nei riquadri. Indicare la stereochimica quando opportuno.

17) Scrivere i prodotti delle seguenti reazioni: 

18) Completare il seguente schema inserendo le condizioni di reazione o i prodotti mancanti nei riquadri. Evidenziare la stereochimica quando opportuno.

19) Proporre una strategia per la sintesi della butanammide a partire da acido butanoico

20) Proporre una strategia per la sintesi di 1-butanammina a partire da 1-bromobutano

Reazioni di sostituzione nucleofila acilica e di addizione nucleofila ai composti carbonilici

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PRIMA DI SVOLGERE QUESTI ESERCIZI è NECESSARIO STUDIARE I CAP. 15 e 16 del Bruice

1) Indicare i prodotti della reazione dell’acetone (=propanone) e dell’acetato di etile con i seguenti composti (se la reazione avviene). Indicare le opportune condizioni di reazione e mostrare il meccanismo.
a) metanammina
b) dimetilammina
c) metanolo
d) bromuro di etilmagnesio
e) NaBH4
 

2) Indicare il reattivo di Grignard e il composto carbonilico opportuni per ottenere i seguenti alcoli. Quando sono possibili più strategie, mostrarle tutte. Mostrare il meccanismo e indicare la stereochimica dei prodotti, se opportuno.
a) 1-esanolo
b) 2-esanolo
c) 1-cicloesil-1-pentanolo
d) 1-etilcicloesan-1-olo
e) 2-ciclopentil-2-propanolo
Esercizi guida

3) Partendo da acido acetico (=acido etanoico) indicare le condizioni e il meccanismo di reazione (quando possibile) per ottenere i seguenti composti:
a) cloruro di acetile
b) anidride acetica
c) acetato di etile
d) N-metilacetammide
e) etanolo
f) 2-metil-2-propanolo
g) 2-metil-1-propanolo
h) etanale
i) (1R)-1-cicloesiletanolo + (1S)-1-cicloesiletanolo
l) 2-propanolo
m) (2R)-1-ammino-2-propanolo + (2S)-1-ammino-2-propanolo
n) 2-metil-4-penten-2-olo
o) 2-metil-1,2-propandiolo
p) 1,2-propandiolo
q) 1-bromo-1-etilciclopentano
r) etanoato di etile (utilizzando l’acido acetico come unica fonte di atomi di carbonio)
s) (3R)-3-bromo-3-metilesano + (3S)-3-bromo-3-metilesano
t) 3-etossi-3-metilpentano (utilizzando l’acido acetico come unica fonte di atomi di carbonio)
u) 2-eptanone
v) 2,2-dimetossipropano
z) (2S,3S)-3-metil-2-pentanolo + (2S,3S)-3-metil-2-pentanolo (utilizzando l’acido acetico come unica fonte di atomi di carbonio)
NB: per la sintesi di molti di questi composti sono necessari più passaggi (sintesi che richiedono numerosi passaggi non saranno oggetto della prova intercorso, ma potranno ovviamente essere oggetto dell’esame orale). Fare attenzione alla corretta sequenza di reazioni e alla reattività dei diversi gruppi funzionali nei confronti dei diversi reattivi. E’ possibile aggiungere fonti di atomi di C diverse dall’acido acetico, ammenochè non sia diversamente indicato nella traccia.
Esercizi guida

4) Mostrare come è possibile convertire l’1-bromobutano in:
a) 1-pentanolo
b) 3-eptanolo
c) 1-esanolo
d) 2-metil-2-esanolo
d) pentanammide
e) butanammide

5) Mostrare come è possibile ottenere il 2-metil-2-butanolo a partire dal 1-propanolo

6) Proporre un meccanismo per le seguenti trasformazioni:

Suggerimenti

CdL Scienze Biologiche-Modifica Orario delle lezioni; riprogrammazione e programma dell’ultima prova intercorso

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Di seguito il risultato della votazione di oggi

Visto che l’87% dei votanti si è detto favorevole, saranno effettuate le modifiche proposte.

Dunque:

La lezione del 20 è anticipata a venerdì 13. Faremo, quindi, lezione di chimica organica dalle 9 alle 13 (con un’ampia pausa tra le prime due ore e il resto della lezione).


Le lezioni del 16 e del 18 restano invariate.

La prova intercorso si terrà il giorno 20 dicembre, dalle 9 alle 11.

Qui è possibile scaricare la lista degli argomenti oggetto della prova intercorso: https://www.dropbox.com/scl/fi/xldgns31j2falxrx27fov/Argomenti-ultima-prova.pdf?rlkey=gcq76vjdwykdjcycvl238i48z&st=8ezsu021&dl=0 per chi non era a lezione, si consiglia di visionare la legenda presente nella seconda pagina. Per chi era a lezione, si consiglia comunque di visionare questa versione, che è stata attentamente revisionata. Qualsiasi dubbio potrà essere sciolto venerdì nel corso della lezione.

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