NMR-based metabolomics

Una delle tecniche utilizzate in metabolomica è la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR).

Questa tecnica, che si basa sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni isotopi, ha tantissime applicazioni ed è certamente insostituibile quando si parla di caratterizzazione di composti organici. In questo contesto, ricordiamo che tra i nuclei attivi all’NMR ci sono l’idrogeno (1H) e il carbonio 13 (13C). La scarsa abbondanza naturale del 13C, insieme ad altre caratteristiche di questo nucleo, fanno sì che nel caso della metabolomica sia molto più pratico lavorare con 1H-NMR.

Dall’analisi NMR di un campione si possono dedurre tante informazioni diverse. Ma come si effettua un’analisi metabolomica mediante NMR?

A partire dal materiale liofilizzato, si ottengono gli estratti con una procedura molto semplice che prevede l’estrazione diretta in solventi deuterati (necessari per l’analisi NMR). Questi estratti vengono analizzati, ottenendo gli spettri, che saranno poi processati: questo processing prevede l’apodizzazione, la fasatura, la calibrazione rispetto allo standard intetno e la correzione della linea di base

A questo punto si procede con l’integrazione. Questa è effettuata attraverso il processo di bucketing o binnig: lo spettro si divide in tanti segmenti di lunghezza definita (in genere 0.02 o 0.04 ppm) e si procede ad integrare l’area sotto la curva di ogni bucket. Si ottiene in questo modo una matrice di dati in cui le osservazioni sono i singoli campioni analizzati e le variabili sono i vari bucket, che assumeranno quindi il valore dell’area per quella parte dello spettro in ciascun campione (NB: le aree sono in genere normalizzate rispetto allo standard interno a alla total intensity).

La matrice di dati così ottenuta è sottoposta ad analisi statistica multivariata. Questa sarà utile ad estrarre le informazioni significative dal nostro set di dati.

Una volta identificati i seganli NMR significativi per la nostra analisi, è necessario “tradurre” questi segnali in metaboliti. Si opera a questo punto per step successivi.
Il primo passaggio è quello del confronto con la letteratura e con i database. A questo proposito, è necessario sottolineare come l’NMR sia una metodica altamente riproducibile. In ogni caso, se questa ricerca non ci dà la risposta sperata, si può optare per l’analisi NMR bidimensionale (2D NMR).I metodi 2D NMR più utilizzati in metabolomica sono brevemente descritti di seguito.

COSY (COrrelation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare correlazioni omonucleari 1H-1H tra protoni vicinali e geminali

TOCSY (TOtal Correlation SpecroscopY)

Esperimento 2D omocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin (il trasferimento di magnetizzazione è interrotto da carboni quaternari).

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni dirette protone-carbonio. Permette quindi di attribuire il valore di chemical shift del carbonio per ciascun carbonio protonato presente nell’estratto (o nella molecola, quando lo spettro si riferisce ad un composto puro)

H2BC (Heteronuclear 2 bond correlation)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e il carboni vicinale, a patto che quest’ultimo sia protonato.

Correlazioni selezionate indicate sullo spettro e sulla struttura con lo stesso colore

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare le correlazioni tra un protone e carboni distanti due, tre o quattro legami. Un esperimento alternativo è noto come CIGAR-HMBC.

Sono evidenziate le correlazioni del composto mostrato in alto a sinistra. Le altre correlazioni appartengono ad altre componenti dell’estratto.

HSQC-TOCSY

Esperimento 2D eterocorrelato. Permette di rilevare sistemi di spin, che in questo caso includono sia i protoni sia i carboni.

Grazie alla combinazione delle informazioni che si ottengono dai diversi spettri 2D NMR, è possibile identificare i costituenti dell’estratto anche in miscela. Per metaboliti già noti, a questo punto sarà possibile confrontare i dati NMR con quelli riportati in letteratura o con quelli degli standard (a patto che siano acquisiti nello stesso solvente). Per i composti identificati per la prima volta, al fine di confermare la struttura, saranno necessari l’isolamento (che a questo punto sarà facilitato dalle informazioni preliminari in nostro possesso circa la struttura del composto) e la completa caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche.
Va infine ricordato che oltre ad identificare i componenti dell’estratto, è anche possibile quantificarli dato che l’ 1H NMR è una tecnica quantitativa (se gli spettri sono acquisiti con determinati parametri) e che è sufficiente in questo caso utilizzare uno standard interno a concentrazione nota.

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