Chimica Organica-DiSTABiF

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica che non ha rivali nell’ambito della caratterizzazione strutturale. Questa tecnica spettroscopica, che sfrutta le proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi, ci permette di avere informazioni fondamentali sui composti organici. Non tutti i nuclei sono attivi all’NMR, ma tra quelli attivi si annoverano il protone e l’isotopo ¹³C del carbonio ed è proprio grazie all’applicazione a questi nuclei che otteniamo informazioni strutturali fondamentali per poter identificare la struttura dei composti.

Da uno spettro protonico possiamo dedurre numerose informazioni: il chemical shift ci dà informazioni su quello che è l’intorno chimico, la molteplicità ci dà informazioni sul numero di protoni legati ai carboni vicini (con le costanti di accoppiamento che ci forniscono altre importanti informazioni strutturali), infine l’integrazione ci permette di avere informazioni di tipo quantitativo.
L’utilizzo di techinche 2D-NMR, inoltre, ci dà la possibilità di ricostruire l’intero scheletro delle molecole.
In che modo possiamo sfruttare tutte queste potenzialità in metabolomica? Lo vedremo nel corso delle prossime lezioni.

Intanto, cerchiamo di capire meglio il principio di base su cui poggia questa potentissima tecnicha.
Di seguito, due video che possono aiutarci. Il primo, prodotto dalla Bruker, il secondo da Sciencesketch.

Curiosi anche di sapere come è fatto lo strumento all’interno? Date un’occhiata qui!

Le due tecniche più utilizzate ad oggi per acquisire i dati in metabolomica sono senza dubbio la spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risononanza magnetica nucleare (NMR).
La prima sfrutta la possibilità di generare e separare ioni in base al loro rapporto massa/carica. A lezione abbiamo visto che in realtà esistono tantissime applicazioni (ed “evoluzioni”) diverse di questa tecnica che la rendono particolarmente utile nell’analisi metabolomica. Il video seguente illustra, invece, il principio di base.

In una serie di video proposti dalla Waters, è possibile capire più a fondo il principio di funzionamente dell’ESI (Elettrospray ionization), che abbiamo visto essere insieme all’APCI e al MALDI (con tutte le variazioni sul tema viste a lezione) una delle tecniche di ionizzazione più diffuse quando la MS è utilizzata in metabolomica. Per quanto riguarda gli analizzatori, è possibile vedere come è fatto un quadrupolo.
Inoltre, è possibile approfondire la problematica della formazione di addotti, della formazione di specie con carica multipla, nonchè la questione dei picchi isotopici. Infine, viene affrontata la questione importantissima della risoluzione.

L’alta risoluzione è, in effetti, fondamentale nell’analisi metabolomica e, come abbiamo visto, anche l’applicazione della MS/MS aggiunge notevoli vantaggi in termini di determinazione dell’identità delle molecole. Nel seguente video è possibile seguire gli ioni nel loro cammino nel caso di un esperimento LC-MS/MS

Dal sito Bruker è possibile vedere come funziona un MALDI-TOF-TOF e da quello dell’Agilent come funziona un triplo quadrupolo associato ad un gas cromatografo o ad un HPLC/UPLC.

Le tecniche di HR-MS e MS/MS (o tandem MS) hanno notevolmente contribuito all’applicazione odierna di questa tecnica in campo metabolomico.
Inoltre, non va dimenticata la possibilità offerta dalle tecniche di imaging da un lato e dall’applicazione di tecnologie ancora più avanzate dall’altro.
Come non menzionare, allora, l’utilizzo della ion mobility mass spectrometry, che separa gli ioni non solo in base al rapporto massa/carica ma anche in funzione della loro grandezza e forma.

Le più recenti applicazioni della spettrometria di massa in metabolomica sono state trattate in una review recente “Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites” (Ren at al., RSC Advances, 2018).

Le tecniche cromatografiche rivestono un ruolo cruciale nell’analisi metabolomica.
Qui troverete alcuni video e animazioni che possono aiutarvi a visualizzare meglio alcune delle tecniche introdotte al corso.

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

HPLC

GC

Prime lezioni di metabolomica perse?

Qui troverai delle risorse utili…Segui il link:

Introduzione alla metabolomica (contenuti: definizione di metaboloma e metabolomica, note sull’importanza di questo tipo di approccio e campi di applicazione, panoramica di quello che è l’approccio dal punto di vista metodologico).

E alla fine potrai anche testare le tue conoscenze

Inoltre, nella sezione “Materiale del corso” (nella cartella “File”) dell’aula virtuale saranno rese disponibili a breve le slide delle prime due lezioni del corso, insieme ad altro materiale utile allo studio.

L’analisi metabolomica prevede vari step e ognuno di questi porta con se una certa variabilità.
La standardizzazione delle procedure analitiche, di analisi e presentazione dei dati è di fondamentale importanza per poter “parlare” un linguaggio comune che permetta di confrontare i risultati di esperimenti diversi.

Sul sito della Metabolomics Society, alla pagina dedicata, è possibile leggere informazioni importanti su questo punto. La pagina riporta anche una serie di link a progetti e pubblicazioni.

Oltre a quelle riportate sul sito, vi consiglio anche i “Proposed minimum reporting standards for chemical analysis” e “for data analysis” e l’articolo “Metabolite identification: are you sure? And how do your peers gauge your confidence?”

Una ricostruzione 3D della cellula eucariotica è stata pubblicata di recente: il modello è stato ottenuto combinando dati ottenuti, per i singoli componenti molecolari, mediante raggi X, NMR e microscopia crioelettronica. Si tratta di un tentativo di ricostruire la miriade di pathway coinvolti nei processi di trasduzione del segnale, sintesi proteica, endocitosi, ecc. e di visualizzare la grande complessità e la bellezza della “coreografia molecolare” della cellula.
Purtroppo solo alcune delle immagini possono essere visualizzate gratuitamente, ma vi consiglio di dare uno sguardo: è anche possibile mettere in evidenza specifici processi o vie metaboliche!
Basta seguire i link nel testo sopra!

Nei giorni 27-29 Ottobre, si è tenuta la conferenza “Metabolomics 2020”.
Le conferenze scientifiche sono sempre fonte di informazioni preziose sulle ultime novità nel settore di riferimento. In questa conferenza ci sono stati tanti interventi molto interessanti, per cui ho pensato di condividerli con voi. Ai seguenti link è possibile scaricare la lista dei titoli degli interventi presentati come presentazione orale e come poster.

Vi invito a darci uno sguardo e a mettere in evidenza quegli interventi che possano essere di vostro interesse. Aggiungete i titoli di questi interventi nei commenti al post.
Tali argomenti saranno oggetto (insieme ad altri) degli approfondimenti che faremo nella seconda parte del corso.